Фармакогенетические аспекты безопасности терапии высокодозным метотрексатом острого лимфобластного лейкоза у детей

Введение

Лекарственная токсичность при терапии высокодозным метотрексатом (МТХ 1000–5000 мг/м²) острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) у детей является актуальным направлений современных исследований, ведь значительные успехи в достижении многолетних полных ремиссий сопряжены с высокой долей побочных эффектов, связанных с терапией ОЛЛ [1, 2]. В мировой литературе подчёркивается многофакторность причин развития тяжёлых нежелательных лекарственных реакций при терапии с включением МТХ в высоких дозах [3]. Согласно современным научным данным, отмечается значительная межиндивидуальная вариабельность токсичности лекарственных средств, в связи с чем роль фармакогенетики (ФГ) в выявлении полиморфных вариантов генов-кандидатов, для оптимизации терапевтических подходов весьма высока [4].

Белки-транспортёры экспрессируются в разных тканях и оказывают значительный эффект на фармакокинетику (ФК) метотрексата (его абсорбцию, распределение и элиминацию), основного препарата протоколов лечения ОЛЛ. Среди множества генов-кандидатов в данной работе в качестве биомаркеров были выбраны гены белков-транспортёров: ген SLCO1B1, переносчик органических анионов растворённого вещества 1B1, и ген ABCB1 (аденозинтрифосфатсвязывающая кассета подсемейства B, член 1), кодирующий аденозинтрифосфатзависимый насос, также называемый геном множественной лекарственной резистентности (MDR1, MIM *171050), которые, по данным крупных рандомизированных исследований, были связаны с развитием тяжёлой нейтропении и оказывали влияние на безопасность и эффективность терапии [5, 6]. Согласно данным систематического обзора 2024 г. под руководством Rahmayanti SU, et al. выявлены наиболее изучаемые гены c 2021 г. по 2024 г. в отношении ФК МТХ: MTHFR, ABCB1, ABCC2, SLCO1B1 [7].

Управление частотой побочных лекарственных реакций, связанных с применением высоких доз метотрексата, до сих пор остаётся проблемой, а редукция доз или прекращение введения цитотоксических препаратов по причине токсических осложнений способствует снижению общей эффективности терапии. Это связано с тем, что индивидуальная переносимость MTX различается, зависит от пола, этнической группы, а также генетических полиморфизмов, транспортёров, метаболизирующих ферментов и мишеней, участвующих в клеточном пути MTX [6].

Цель

Оценить влияние полиморфизмов генов ABCB1 (C3435T rs1045642, C1236T rs1128503, 2677G>T/A rs2032582, С>T rs4148738), SLCO1B1 T521C rs4149056 на профиль безопасности терапии метотрексатом у детей с ОЛЛ.

Материалы и методы

Протокол исследования был одобрен Комитетом по этике научных исследований ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. Проспективный анализ базы данных пациентов детского возраста с ОЛЛ в рамках когортного одноцентрового исследования был проведён в отделении детской онкологии и гематологии (химиотерапии гемобластозов) №1 в НИИ детской онкологии и гематологии имени академика РАМН Л.А. Дурнова ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России.

Критерии включения: возраст от 1 месяца до 18 лет; подтверждённый диагноз острого лимфобластного лейкоза (МКБ С91.0); получение информированного добровольного согласия законного представителя на участие в исследовании.

Критерии исключения: выраженная соматическая патология (патология печени, почек, сердечно-сосудистой, нервной систем); препятствующая проведению программной химиотерапии; психотическое состояние или тяжёлое психическое заболевание в анамнезе (шизофрения, эпилепсия, биполярное расстройство и т. п.); одновременный приём препаратов, влияющих на фармакокинетику и/или фармакодинамику метотрексата; отказ от подписания информированного добровольного согласия или отказ от продолжения участия в исследовании, оформленные законным представителем в письменной форме.

В исследование включены 124 ребёнка с установленным диагнозом ОЛЛ, получавших терапию по протоколам ALL IC-BFM 2009/ ALL REZ BFM 2002 c использованием высокодозного метотрексата (>1 г/м²) в отделении детской онкологии и гематологии (химиотерапии гемобластозов) №1 НИИ детской онкологии и гематологии имени академика РАМН Л.А. Дурнова ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. Для определения степеней нежелательных реакций (НР) применялись лабораторные методы с использованием критериев токсичности NCI (CTCAE v5.0 2018 года).

Материал исследования — периферическая кровь, время забора материала не регламентировано. Определение однонуклеотидных генетических полиморфизмов изучаемых генов проводилось методом аллель-специфической полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени на приборе CFX96 Touch Real Time System с программным обеспечением CFX Manager версии 3.0 (BioRad, США). Носительство полиморфных маркеров определялось с помощью коммерческих наборов реагентов для определения соответствующих полиморфизмов (ООО «Синтол», Россия) и коммерческого набора «TaqMan^®SNP Genotyping Assays» и TaqMan Universal Master Mix II, no UNG (Applied Biosystems, США).

Для статистической обработки результатов использовалась программа SPSS Statistics 26.0 (США). Расчёт объёма выборки производился с учётом таких параметров: мощность: 80 %, двусторонний тест, α=0,05; эффект — наблюдаемые доли (p1 и p0). Для бинарных исходов (наличие выраженной токсичности) объём выборки оценивали по различию долей между группами генотипов с использованием нормальной аппроксимации через эффект Коэна h. Если брать один клинически значимый эндпоинт с умеренным эффектом (например, мукозит ≥3 ст. при rs1128503: CC~0,66 vs CT/TT~0,45), для 80 % мощности при α=0,05 нужно 190–200 пациентов. Для множественных сравнений (несколько SNP × токсичность) при мощности 80 % и α=0,05 нужно 300 пациентов. При ненормальном распределении данных количественный показатель представлялся в виде медианы (Ме) с интерквартильным размахом (25–75 % Q1–3). Межгрупповые различия при ненормальном распределении оценивались с помощью U-критерий Манна–Уитни. Анализ ассоциаций проводился с помощью таблиц сопряжённости 2×2, χ² Пирсона, точного критерия Фишера и однофакторной логистической регрессии без учёта ковариат. Для контроля множественных сравнений использовались коррекции Бонферрони, Холма–Бонферрони и процедура частоты ложных открытий Бенджамини–Хохберга (FDR по Benjamini–Hochberg). Базовый уровень значимости — α=0,05.

Результаты

Частоты генотипов изученных полиморфных вариантов гена ABCB1 rs1045642, rs1128503 и SLCO1B1 T521C rs4149056 в исследуемой популяции соответствовали равновесию Харди–Вайнберга, за исключением rs2032582 и rs4148738 (р <0,05), что свидетельствует о неполной репрезентативности настоящей выборки (табл. 1).

Таблица 1. Распределение генотипов изученных полиморфных вариантов генов у пациентов с расчётом соответствия равновесию Харди–Вайнберга (HWE), (n=124)

После коррекции по Бонферрони и Холма–Бонферрони значимость ассоциаций не сохранялась (p ≥0,14). При контроле FDR по Benjamini–Hochberg все четыре ассоциации оставались значимыми (q=0,047). Следует отметить, что результаты ассоциаций чувствительны к методу коррекции. Строгая поправка Бонферрони может приводить к потере истинных сигналов при ограниченном размере выборки, тогда как FDR по Benjamini–Hochberg (BH-FDR) позволяет контролировать долю ложноположительных находок и более подходит для фармакогенетических исследований с множеством SNP и фенотипов.

Таблица 2. Коррекция множественных сравнений

Анализ эффективности терапии МТХ представлен в опубликованных нами ранее статьях [8, 9]. Клинические и терапевтические характеристики пациентов (n=124), включённых в настоящее исследование по оценке безопасности терапии МТХ, приведены в табл. 3.

Таблица 3. Клинические и терапевтические характеристики пациентов, вошедших в исследование

На основании данных историй болезни и исследованных образцов периферической крови 124 пациентов, установлено: соотношение пациентов мужского (n=70) и женского (n=54) пола составило 1,2/1, медиана возраста — 7 лет. Преобладал В-линейный иммуноподвариант ОЛЛ — 67,7 %. Среди групп риска в исследуемой выборке преобладала группа среднего риска (48,4 %). В исследуемой популяции доминировали выраженные нежелательные реакции (НР) >3 степени в виде: гематологической токсичности (87,9 %), орофарингеального мукозита (51,6 %), гепатотоксичности (46 %), инфекционных осложнений (34,6 %), нейротоксичности (7,2 %); нефротоксичность проявлялась в виде невыраженных НР 1–2 степени (100 %). При этом, чем выше частота встречаемости выраженных гемато-, гепатотоксичности и орофарингеального мукозита, тем выше частота инфекционных осложнений (р <0,001), табл. 4.

Таблица 4. Сравнительный анализ частоты встречаемости гематологической токсичности, мукозита, гепатотоксичности и инфекционных осложнений при терапии МТХ у детей с ОЛЛ

С помощью ассоциативного анализа, критерия χ² Пирсона и таблиц сопряжённости установлено: полиморфный вариант ABCB1 1236C>T является значимым предиктором развития орофарингеального мукозита при терапии МТХ, большая выраженность НР показана для гомозигот CC, у пациентов с генотипом TT гена SLCO1B1 T521C rs4149056 повышен риск развития выраженных инфекционных осложнений в 2,7 раза, у пациентов с генотипом TT гена ABCB1 C3435T определяется повышенный риск развития нефротоксичности (p=0,035, ОШ: 8,3 (95 % ДИ: 0,83–82,2) и нейротоксичности (p=0,041, ОШ: 2,3 (95 % ДИ: 1,02–5,12). Однако учитывая крайне широкий ДИ и малое число пациентов с генотипом TT гена ABCB1 C3435T, результаты ассоциации с нефротоксичностью требуют дополнительного анализа. Другие виды токсических НР на МТХ во взаимосвязи с носительством полиморфизмов генов ABCB1 и SLCO1B1 не показали достоверных различий (табл. 5).

Таблица 5. Сравнительный анализ частоты НР при терапии МТХ у детей с ОЛЛ в зависимости от полиморфных вариантов исследуемых генов

Кроме ассоциативного анализа полиморфизмов генов ABCB1 и SLCO1B1 с НР для оценки безопасности терапии метотрексатом проведён поиск взаимосвязей полиморфизмов, изучаемых нами генов с задержкой элиминации МТХ на 54 час и более, статистически значимых различий получено не было (табл. 6). Время экскреции МТХ у пациентов с разными генотипами отличалось незначимо (медианы составляли 48 ч).

Таблица 6. Результаты ассоциативного анализа полиморфизмов генов ABCB1 и SLCO1B1 с наличием или отсутствием экскреции МТХ на 54 ч

Остальные же изучаемые нами полиморфные варианты генов белков-переносчиков не показали значимого влияния на развитие НР при терапии МТХ в связи с недостаточной мощностью исследования, не полным соответствием равновесию Харди-Вайнберга.

Ограничения исследования

 Настоящее исследование имеет ряд ограничений, которые необходимо учитывать при интерпретации результатов. Во-первых, не был учтён вклад таких факторов, как полиморфные варианты генов фолатного и метионинового путей, участвующих во 2-й фазе метаболизма и транспорте МТХ. Также режим дозирования МТХ не анализировался в контексте развития выраженных НР, так как все пациенты получили высокие дозы МТХ (> 1г/м² внутривенно капельно за 24 часа). Во-вторых, увеличение размера выборки может увеличить статистическую значимость анализа связи МТХ с проявлениями токсичности. Низкая доля редких генотипов и ограниченный общий объём выборки приводят к снижению статистической мощности отдельных сравнений. В-третьих, отсутствие контрольной группы в нашем исследовании лишает возможности интерпретировать отклонение от ожидаемого. Интерпретация процедуры частоты ложных открытий (FDR Бенджамини–Хохберга) зависит от определения семейства гипотез; при расширении семейства (включая дополнительные сравнения) q‑значения возрастают. В данной работе не проводился мультивариабельный регрессионный анализ с учётом ковариат, что могло повлиять на выявленные ассоциации. Планируется выполнить такой анализ в дальнейшем на более крупной выборке.

Обсуждение

Ген ABCВ1 кодирует P-гликопротеин (P-Gp), который влияет на биодоступность токсичных веществ и метаболитов лекарственных средств, включая MTX. Ранее проведённые исследования показали, что полиморфизмы гена ABCB1 могут влиять на иммунный ответ и апоптоз клеток, играющих важную роль в развитии различных видов онкопатологий, включая рак молочной железы, рак желудка, рак лёгкого, лейкоз [10]. Полиморфизмы rs1045642 являются наиболее изученными в отношении ФК МТХ, снижают активность P-Gp и уменьшают количество белков-переносчиков, что приводит к внутриклеточному накоплению лекарственных препаратов, таких как MTX [7, 11, 12]. Изменение нуклеотида С на Т в позиции 3435 приводит к накоплению высоких концентраций внутриклеточных метаболитов МТХ и более низких в плазме крови из-за снижения эффлюкса препарата через мембранный P-Gp. Генотип CC сильнее ассоциирован с повышенной экспозицией MTX и более высокой вероятностью замедленного клиренса, чем генотип TT [13, 14].

Guo Q, et al. показали, что полиморфизмы rs1045642 не изменили ФК МТХ, но у пациентов с гомозиготным генотипом TT с большей вероятностью отмечается повышенная токсичность, связанная с MTX (лейкопения, нейтропения и орофарингеальный мукозит), чем у пациентов с генотипом CC [15]. Обнаруженные результаты согласуются с теорией механизма, посредством которого конкретный ген влияет на уровень и токсичность МТХ, но её клиническая значимость и полезность для принятия персонализированных решений о лечении ещё не установлена [7].

Исследования Ramsey LB, et al. в 2013 г. подтвердили, что полиморфизмы SLCO1B1 играют большую роль в выведение МТХ из организма [16]. Radtke S, et al. подтвердили, что полиморфизм rs4149056 имел значительную связь с элиминацией МТХ, с каждой копией аллеля C в rs4149056 элиминация МТХ снижается на 12 мл/мин/м²; таким образом, у пациентов с генотипом CC элиминация примерно на 13 % ниже, чем у пациентов с генотипами TT [17].

Приведённые данные зарубежной литературы определяют актуальное направление ФГ исследований в российской педиатрической популяции больных. Ограничениями, которых в настоящее время являются недостаточный размер выборки, гетерогенность протоколов лечения, которые могут различаться по способу введения, дозировке лекарственных средств, сопутствующим препаратам и продолжительности лечения. Однако продуманный и тщательный дизайн исследования в более крупной и разнообразной популяции больных и соответствие исследуемых полиморфизмов равновесию Харди–Вайнберга может устранить эти препятствия и облегчить внедрение результатов ФГ исследований в клинические условия, ведь выявление биомаркеров, позволяющих прогнозировать ответ на терапию и тяжесть ожидаемых токсических явлений при лечении ОЛЛ, открывающиеся возможности оптимизации фармакотерапии на основании этих данных, являются перспективным и современным направлением клинической онкогематологии.

Заключение

Полиморфные варианты генов ABCB1 и SLCO1B1 являются значимыми прогностическими факторами безопасности применения МТХ. На основании результатов проведённого анализа безопасности терапии высокодозным МТХ показана необходимость проведения масштабного фармакогенетического тестирования перед попытками внедрения в реальную клиническую практику. С целью усовершенствования и повышения качества ФГ исследований необходимо изучение не только генов белков-переносчиков, но и ферментов, имеющих значительную роль в фармакокинетике и фармакодинамике МТХ. Гаплотипический и комбинаторный анализ сцепленных однонуклеотидных полиморфизмов разных участников транспортного и метаболического путей может повысить точность анализа взаимосвязей генов с НР, что будет иметь большее значение для оптимизации терапии детей с ОЛЛ в перспективе и являться поводом для дальнейшего проведения клинических исследований, направленных на персонализацию химиотерапии в зависимости от индивидуальных особенностей пациентов.