Полиморфизмы CYP2A6 как предикторы эффективности ЭКО: роль локального метаболизма эстрогенов в условиях гиперэстрогении

Введение

Несмотря на впечатляющий прогресс вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) за последние десятилетия, эффективность программ экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) остаётся ограниченной. По данным Европейского общества репродукции человека и эмбриологии, частота наступления клинической беременности в расчёте на одну попытку переноса эмбрионов не превышает 35 % в ведущих репродуктивных центрах [1]. Поиск прогностических биомаркеров, позволяющих персонализировать протоколы подготовки эндометрия и гормональной поддержки лютеиновой фазы, остаётся приоритетным направлением фундаментальных и клинических исследований в этой области.

В последние годы всё большее внимание исследователей привлекает система цитохрома Р450 (CYP450) — суперсемейства ферментов I фазы метаболизма ксенобиотиков и эндогенных соединений. Традиционно эти ферменты рассматривались преимущественно в контексте печёночного метаболизма лекарственных препаратов, однако накоплены убедительные данные об их внепечёночной экспрессии и участии в регуляции стероидного гомеостаза. В частности, фермент CYP2A6 представляет особый интерес в контексте репродуктивной физиологии. Иммуногистохимические исследования продемонстрировали, что CYP2A6 экспрессируется в тканях, чувствительных к половым стероидам, включая яичники, матку, молочную железу, яички и надпочечники [2]. Более того, в промоторе гена CYP2A6 идентифицирован функциональный эстроген-респонсивный элемент (ERE), и подтверждено прямое связывание рецептора ERα с этим элементом [2]. Уровень белка CYP2A6 в железистых клетках эндометрия значительно выше в пролиферативную фазу менструального цикла, что коррелирует с локальной секрецией эстрогенов и указывает на биологическую роль этого фермента в эстроген-чувствительных тканях [2]. Индукция CYP2A6 наблюдается во время беременности, что позволяет предположить специфическую роль гормональной регуляции CYP2A6 в гестационном периоде [3, 4]. Известно, что конститутивная активность CYP2A6 выше у женщин, чем у мужчин, а приём пероральных эстрогенсодержащих контрацептивов или гормональной заместительной терапии дополнительно повышает ферментативную активность [5, 6]. При этом различия в активности CYP2A6 между мужчинами и женщинами в постменопаузе отсутствуют, что подтверждает определяющую роль эстрогенов в регуляции экспрессии этого гена [5]. Прогестерон также способен модулировать экспрессию CYP2A6, хотя и в меньшей степени, чем эстроген [3]. Таким образом, CYP2A6 является гормон-чувствительным геном, экспрессия которого регулируется ключевыми стероидами, участвующими в подготовке эндометрия к имплантации и поддержании беременности.

Ген CYP2A6 локализован на длинном плече хромосомы 19 локусе 13.2 в составе генного кластера протяжённостью около 350 т.п.н., включающего также подсемейства CYP2A7, CYP2A13, CYP2B и CYP2F [7, 8]. Ген CYP2A6 характеризуется исключительно высоким уровнем генетического полиморфизма: на сегодняшний день охарактеризовано более 40 аллельных вариантов [9]. Наследуемость CYP2A6-опосредованного метаболизма оценивается в 60–80 % [9]. С помощью методов секвенирования нового поколения идентифицированы семь высокочастотных некодирующих однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), вносящих значительный вклад в фенотипическую вариабельность активности фермента, включая rs57837628, rs56113850 и rs8192733 [10].

Большинство исследований, посвящённых роли CYP2A6 в репродуктивной медицине, фокусировались на его участии в метаболизме летрозола — ингибитора ароматазы, широко применяемого для индукции овуляции у пациенток с синдромом поликистозных яичников (СПКЯ) [11]. Вместе с тем, эндогенная роль CYP2A6 в физиологии репродуктивной системы остаётся практически не изученной в контексте исходов ЭКО, особенно у пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием, где основным методом лечения является ЭКО, а не медикаментозная индукция овуляции. Учитывая вышеизложенное, можно предположить, что генетические варианты CYP2A6 влияют на рецептивность эндометрия, эффективность имплантации и исходы программ ЭКО.

Цель исследования

Оценить ассоциацию полиморфизмов гена CYP2A6 с исходами программ ЭКО у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием.

Материалы и методы

Дизайн и участники. Работа выполнена в формате проспективного пилотного исследования, одобренного Локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «МГУ им. Н. П. Огарева» (протокол №116 от 12.05.2023). В период с мая 2023 г. по январь 2025 г. на базе отделения ВРТ перинатального центра ГБУЗ Республики Мордовия «МРЦКБ» проведён скрининг 270 пациенток с верифицированным диагнозом трубно-перитонеального бесплодия (код по МКБ-10: N97.1). Все участницы подписали добровольное информированное согласие на участие в исследовании и обработку персональных данных. Возрастной диапазон составил 25–35 лет (31,4±3,7 года); все женщины принадлежали к европеоидной популяции.

Протокол ЭКО. Пациенткам выполняли стандартизированные циклы ЭКО с использованием собственных ооцитов. Контролируемая овариальная стимуляция (КОС) проводилась по короткому протоколу с антагонистами гонадотропин-рилизинг-гормона (ганиреликс или цетрореликс в суточной дозе 0,25 мг подкожно) в комбинации с рекомбинантным фолликулостимулирующим гормоном (фоллитропин альфа) в начальной дозе 100–150 МЕ/сут с последующей индивидуальной коррекцией. Финальное созревание ооцитов инициировали подкожным введением 250 мкг хорионадотропина альфа. Все лечебные мероприятия соответствовали актуальным Национальным клиническим рекомендациям по диагностике и лечению женского бесплодия с применением ВРТ.

Формирование выборки и критерии отбора. Из общего числа обследованных для финального анализа отобраны 96 пациенток в соответствии с заранее определёнными критериями. Включение в исследование предусматривало: сохранный овариальный резерв (оценивался по уровню антимюллерова гормона и количеству антральных фолликулов); отсутствие органической патологии эндометрия по данным трансвагинального ультразвукового сканирования и гистероскопии; нормальный кариотип у обоих супругов; перенос эмбрионов хорошего качества. Основаниями для исключения служили: мужской фактор бесплодия; наличие экстрагенитальной или генитальной патологии, являющейся абсолютным противопоказанием к проведению ЭКО; курение; отказ от продолжения участия на любом этапе.

Первичной конечной точкой эффективности служило наступление клинической беременности, подтверждённое ультразвуковой визуализацией плодного яйца и сердцебиения эмбриона на 21-е сутки после переноса. По результатам цикла ЭКО сформированы две сопоставимые группы: в первую (n=48) вошли женщины с наступившей беременностью после первой попытки, во вторую (n=48) — пациентки, у которых беременность не наступила, при этом в анамнезе у них было три и более безрезультативных цикла ЭКО. Группы не различались статистически значимо по возрасту, уровню антимюллерова гормона и числу антральных фолликулов.

Генотипирование. Венозную кровь объёмом 6 мл забирали в вакуумные пробирки с антикоагулянтом ЭДТА. Образцы хранили при -20 °C (кратковременное хранение) и при -70 °C (длительное хранение). Экстракцию геномной ДНК проводили с использованием набора магнитных сорбентов производства компании «Genotek» (Россия) на автоматической станции Allsheng Auto-Pure 96 (Китай). Генотипирование выполнено методом полногеномного сканирования на биочипах Infinium Global Screening Array-24 v3.0 («Illumina», США) с использованием прибора iScan в строгом соответствии с регламентом Infinium HTS Assay Guide [12] на базе лаборатории ООО «ГЕНОТЕК». Исследованы следующие SNP: rs1809810, rs7259706, rs7260629, rs8192733, rs12459249, rs28399433, rs56113850, rs57837628, rs113288603. Все процедуры, связанные с выделением ДНК, генотипированием и хранением генетического материала, осуществлялись исключительно в Российской Федерации без передачи данных за пределы страны, что полностью соответствует нормам Федерального закона № 86-ФЗ «О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности».

Статистическая обработка. Анализ данных проведён в программе Statistica 12.5 (StatSoft, Inc.). Для количественных переменных проверяли нормальность распределения с использованием критерия Шапиро-Уилка; все такие признаки представлены в формате среднего арифметического и стандартного отклонения (M±SD). Межгрупповые различия для количественных показателей оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Для сравнения частот генотипов и аллелей применяли критерий χ² Пирсона; при ожидаемой частоте в ячейке менее 5 использовали точный критерий Фишера. Соответствие распределения генотипов равновесию Харди-Вайнберга проверяли в группе сравнения с помощью χ²-теста. Силу связи между полиморфными вариантами и эффективностью ЭКО оценивали через отношение шансов (ОШ) с 95 % доверительным интервалом (ДИ). Критический уровень значимости принят за 0,05. Ввиду ограниченного размера выборки (n=96) для подтверждения надёжности выявленных ассоциаций проведён пермутационный анализ с использованием процедуры Монте-Карло (10 000 случайных перестановок фенотипических меток при сохранении генотипической структуры). Результат признавали статистически значимым при эмпирическом значении p-rem <0,05.

Результаты

Статистически значимые различия между группами выявлены для двух полиморфизмов: rs8192733 и rs57837628 (p <0,05) (табл. 1). Для остальных пяти полиморфизмов статистически значимых различий между группами не выявлено (p >0,05 во всех случаях) (табл. 1). rs1809810 следует рассматривать как требующий подтверждения в расширенных выборках.

Таблица 1. Распределение генотипов гена CYP2A6 у обследованных женщин с трубно-перитонеальным бесплодием

Примечания: ¹ – ОШ и 95 % ДИ не рассчитаны из-за отсутствия генотипа T/A в группе с наступившей беременностью. ² – p рассчитано по точному критерию Фишера. ³ – p соответствует значению p-rem <0,05 (пермутационный тест Монте-Карло, 10 000 перестановок).

Ограничения исследования

Настоящее исследование имеет ряд ограничений, которые следует учитывать при интерпретации результатов. Во-первых, относительно небольшой объём выборки (n=96) ограничивает статистическую мощность. С целью минимизации риска ложноположительных находок в работе применён пермутационный анализ (10 000 перестановок). Устойчивость ассоциаций полиморфных вариантов rs8192733, rs57837628 при данной процедуре, а также высокий уровень отношения шансов (ОШ >2,3) позволяют заключить, что обнаруженные зависимости не являются артефактами малой выборки и могут рассматриваться как надёжные, несмотря на пилотный статус исследования. Во-вторых, отсутствие прямых измерений активности CYP2A6 в тканях эндометрия или фолликулярной жидкости не позволяет установить непосредственную связь между генотипом и ферментативной активностью в тканях-мишенях. В-третьих, исследование проведено на пациентках одной этнической группы (европеоидной популяции), что ограничивает экстраполяцию результатов на другие популяции, учитывая известные межэтнические различия в распределении аллелей CYP2A6.

Обсуждение

В настоящем исследовании впервые проведён комплексный анализ ассоциаций полиморфных вариантов гена CYP2A6 с исходами программ ЭКО у пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием. Установлены статистически значимые ассоциации для двух полиморфных локусов — rs8192733 и rs57837628. Полученные результаты позволяют сформулировать гипотезу о том, что генетически детерминированная вариабельность активности CYP2A6 модулирует локальный гормональный гомеостаз в эндометрии и яичниках, влияя тем самым на рецептивность эндометрия и успешность имплантации. Ключевым звеном предлагаемой гипотезы является доказанная эстроген-зависимая регуляция экспрессии CYP2A6 [2, 3]. Генетические полиморфизмы, изменяющие активность фермента, вероятно могут влиять на метаболизм эндогенных стероидов в тканях-мишенях, создавая тем самым различный гормональный фон для имплантации эмбриона, особенно в условиях гиперэстрогении.

В программах ЭКО контролируемая овариальная стимуляция закономерно приводит к развитию гиперэстрогении — уровень эстрадиола в день введения триггера финального созревания ооцитов нередко превышает 2000–3000 пг/мл, что в несколько раз выше физиологических пиковых концентраций. Известно, что супрафизиологические уровни эстрадиола, индуцированные КОС, создают субоптимальную преддимплантационную микросреду и снижают рецептивность эндометрия [12]. На молекулярном уровне высокие дозы эстрадиола значимо влияют на экспрессию ключевых генов, участвующих в формировании рецептивности эндометрия, изменяя не только сроки «окна имплантации», но и его молекулярный состав, что потенциально ухудшает успешность имплантации [13].

Полиморфизм rs8192733 расположен в 3'-нетранслируемой области (3'-UTR) гена CYP2A6 и относится к числу регуляторных вариантов, влияющих на его экспрессию. В исследовании Tanner и соавт., rs8192733 идентифицирован как один из семи высокочастотных некодирующих SNP, вносящих значительный вклад в фенотипическую вариабельность CYP2A6 [10]. Кроме того, rs8192733 ассоциирован с увеличением скорости метаболизма никотина [14], что подтверждает его функциональную значимость.

Согласно данным Tanner et al., генотипы С/С и С/С rs8192733 ассоциированы с повышенной скоростью метаболизма субстратов CYP2A6 [10]. В нашем исследовании генотип С/С ассоциирован с наступлением беременности (ОШ=6,922; р <0,001), генотип G/G, напротив, с неблагоприятным исходом ЭКО (ОШ=0,053; р <0,001). В условиях гиперэстрогении, индуцированной КОС, можно предположить, что повышенная активность CYP2A6 (генотип С/С) способствует более эффективной локальной инактивации избыточных эстрогенов в эндометрии, предотвращая негативное влияние супрафизиологических концентраций эстрадиола на рецептивность и «окно имплантации» [13]. Напротив, сниженная активность фермента (генотип G/G) может приводить к замедленному метаболизму эстрогенов, их избыточному накоплению в ткани эндометрия и нарушению имплантации.

Полиморфизм rs57837628 также относится к числу некодирующих регуляторных вариантов, идентифицированный как важный участник фенотипов CYP2A6 и ассоциированный с вариабельностью активности фермента [10].

В нашем исследовании выявлена ассоциация генотипа G/G rs57837628 с 2,4-кратным шансом наступления клинической беременности (ОШ=2,369; р=0,010), генотип A/G продемонстрировал неблагоприятный эффект (ОШ=0,231; р <0,001).

Интерпретация этих результатов требует учёта сложной регуляторной архитектуры локуса CYP2A6. Поскольку rs57837628 является некодирующим регуляторным вариантом, его эффект, вероятно, опосредован изменением уровня экспрессии гена, а не структуры белка. Гомозиготный генотип G/G может обеспечивать высокий уровень экспрессии CYP2A6, достаточный для поддержания физиологического метаболизма стероидов в условиях гиперэстрогении. Гетерозиготный генотип A/G, по-видимому, ассоциирован с более низкой экспрессией, что может способствовать замедленному выведению эстрогенов, формирующим неблагоприятные условия для имплантации. Однако функциональный эффект rs57837628 в литературе окончательно не установлен, и предложенная интерпретация требует экспериментального подтверждения.

В отличие от rs8192733 и rs57837628, ассоциация rs1809810 с исходом ЭКО не была подтверждена пермутационным тестом ввиду отсутствия гетерозигот в группе 1, данный локус требует изучения на расширенных выборках.

Полученные результаты дополняют существующие представления, демонстрируя, что генетическая вариабельность CYP2A6 может иметь клиническое значение не только в контексте метаболизма ксенобиотиков, но и в регуляции репродуктивных процессов. В отличие от работы Kareem et al. [11], где не выявлено влияния полиморфизма CYP2A6 на эффективность летрозола при СПКЯ, наше исследование впервые показывает ассоциацию регуляторных SNP CYP2A6 с исходами ЭКО у пациенток без СПКЯ. Это подчёркивает, что роль CYP2A6 может различаться в зависимости от контекста терапии и типа бесплодия.

Заключение

Таким образом, результаты проведённого исследования свидетельствуют о том, что полиморфные варианты гена CYP2A6 — rs8192733 и rs57837628 — ассоциированы с исходами программ ЭКО у пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием. В рамках предложенной гипотезы о модуляции локального гормонального гомеостаза через генетически детерминированную вариабельность активности CYP2A6, можно сделать вывод, что чрезмерно низкая активность (G/G rs8192733 и, вероятно, A/G rs57837628) в условиях гиперэстрогении может приводить к замедленному метаболизму эстрогенов, их избыточному накоплению и нарушению «окна имплантации». Высокая активность CYP2A6 (C/C rs8192733 и G/G rs57837628) способствует ускоренной локальной инактивации избыточных эстрогенов в эндометрии, предотвращая негативное влияние супрафизиологических концентраций эстрадиола на рецептивность и поддерживая оптимальные условия для имплантации.

Полученные результаты требуют дальнейшей экспериментальной и клинической верификации, однако уже сейчас полученные данные открывают новые перспективы для персонализированного прогнозирования эффективности ВРТ и разработки индивидуальных подходов к гормональной поддержке циклов ЭКО.