Генетические маркеры рецепторов гормонов как предикторы эффективности ЭКО при трубно-перитонеальном бесплодии

Введение

Достижения в области вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) позволили существенно улучшить результаты терапии различных форм бесплодия. Однако, несмотря на стандартизацию подходов, высокая вариабельность индивидуального ответа пациенток на контролируемую овариальную стимуляцию (КОС) остаётся одной из наиболее острых и нерешённых проблем клинической репродуктологии [1, 2]. Существующие стандартные протоколы, базирующиеся преимущественно на клинико-лабораторных и ультразвуковых параметрах, далеко не всегда позволяют с высокой точностью прогнозировать и оптимизировать исходы программ экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).

Накапливающиеся фундаментальные и клинические данные свидетельствуют о том, что ключевым предиктором межиндивидуальных различий в ответе на гонадотропную терапию является генетическая компонента [2-4]. На долю генетических факторов приходится от 20 до 40% дисперсии в индивидуальной реактивности яичников на экзогенные регуляторные сигналы, что напрямую влияет на процессы фолликулогенеза и общую эффективность протоколов ЭКО.

Базовым компонентом ВРТ является КОС, направленная на индукцию мультифолликулярного роста и получение терапевтического пула зрелых ооцитов. Большинство современных схем КОС основано на экзогенном введении препаратов рекомбинантного или мочевого фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) с последующим триггерным введением хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) для запуска финального созревания ооцитов. Интеграция принципов фармакогенетики в практику ведения женщин с бесплодием открывает принципиально новые возможности для персонализации лечения [1-3, 5]. Так, применение индивидуализированных дозировок ФСГ, рассчитанных с учетом генетического профиля пациентки, демонстрирует превосходство над эмпирическими схемами, значимо увеличивая совокупные показатели наступления беременности и рождения живых детей [6].

Согласно данным систематического обзора, до трети межиндивидуальных различий в эффективности ВРТ обусловлено полиморфизмом генов, кодирующих рецепторы гонадотропинов и половых стероидов [5]. Однонуклеотидные варианты (SNP) способны модифицировать уровень экспрессии, аффинность и сигнальный каскад рецепторов-мишеней, а также метаболические пути гормонов, предопределяя тканевую чувствительность к фармакотерапии [2]. В частности, полиморфизмы генов рецепторов гонадотропинов (FSHR, LHCGR) модулируют ответ гранулезных клеток на введение гонадотропных агентов. С другой стороны, генетическая вариабельность рецепторов половых стероидов (ESR1, ESR2, PGR) критически влияет на рецептивность эндометрия и фолликулярное микроокружение в ответ на колебания уровней эстрогенов и прогестерона, что определяет успешность имплантации эмбриона и пролонгирование беременности.

Несмотря на очевидную патогенетическую значимость, результаты существующих исследований изолятов данных полиморфизмов (например, наиболее изученного варианта Asn680Ser гена FSHR или полиморфизма PvuII гена ESR1) остаются крайне противоречивыми и неоднородными, варьируя от полного отсутствия эффекта до диаметрально противоположных клинических ассоциаций [6-9]. Подобная диссоциация результатов диктует необходимость комплексной оценки ген-генотипических профилей в клинически гомогенных группах пациенток.

Цель

Провести комплексную оценку возможной ассоциации полиморфных вариантов генов рецепторов гонадотропинов (FSHR: rs6165, rs6166, rs1394205; LHCGR: rs2293275, rs4073366, rs4953616, rs7579411) и половых стероидных гормонов (ESR1: rs2234693, rs3020394, rs3798577, rs9340799; ESR2: rs4986938; PGR: rs1042838) с частотой наступления клинической беременности в программах ЭКО у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием для выявления потенциально значимых предикторов и последующей персонализации протоколов КОС.

Материалы и методы

В проспективное пилотное исследование, одобренное Локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «МГУ им. Н.П. Огарева» (протокол №116 от 12.05.2023), включены 270 пациенток с верифицированным трубно-перитонеальным бесплодием (МКБ-10: N97.1), наблюдавшихся в отделении ВРТ Перинатального центра ГБУЗ Республики Мордовия «МРЦКБ» в период май 2023 – январь 2025 г. Все участницы предоставили письменное информированное согласие. Возраст — 25-35 лет (M±SD: 31,4±3,7 года), этническая принадлежность — европеоидная.

Всем пациенткам проводилась стандартизированная программа ЭКО с использованием собственных ооцитов. Овариальную стимуляцию осуществляли по короткому протоколу с антагонистами гонадотропин-рилизинг-гормона (ганиреликс или цетрореликс 0,25 мг/сут подкожно) и рекомбинантным ФСГ (фоллитропин альфа в стартовой дозе 150-225 МЕ/сут подкожно с последующей коррекцией); триггером финального созревания ооцитов служил хорионадотропин альфа 250 мкг подкожно. Ведение пациентов осуществлялось в соответствии с действующими Национальными клиническими рекомендациями по лечению женского бесплодия и применению ВРТ.

В финальную выборку вошли 96 пациенток, отобранных по заранее установленных критериев. Критерии включения: возраст 25-35 лет; документально подтверждённое трубно-перитонеальное бесплодие (код по МКБ-10: N97.1); нормальный овариальный резерв; отсутствие патологии эндометрия по данным УЗИ и гистероскопии; нормальный кариотип у обоих партнёров; перенос эмбрионов хорошего качества. Критерии исключения: мужской фактор бесплодия; ИМТ >30 кг/м², экстрагенитальная или генитальная патология, являющаяся абсолютным противопоказанием к ЭКО; отказ от участия на любом этапе исследования.

Первичной конечной точкой являлось наступления клинической беременности, верифицируемой эхографически на 21-е сутки после переноса эмбрионов. По исходу цикла ЭКО сформированы две группы: группа 1 (n=48) — пациентки с наступлением беременности с первой попытки; группа 2 (n=48) — пациентки с ненаступившей беременностью и с тремя и более безрезультатными циклами ЭКО в анамнезе. Группы были сопоставимы по возрасту, индексу массы тела, уровню антимюллерова гормона и количеству антральных фолликулов.

Венозную кровь (6 мл) забирали натощак в вакуумные пробирки с ЭДТА хранили при -20 °С (краткосрочно) и -70 °С (досрочно). Геномную ДНК выделяли с использованием магнитосорбентных реагентов («Genotek», Россия) на автоматизированной платформе Allsheng Auto-Pure 96 (Китай).

Генотипирование 13 SNP, отобранных по результатам систематического обзора литературы как маркёры с предиктивной значимостью в отношении исходов ЭКО, выполняли методом полногеномного типирования на биочипах Infinium Global Screening Array-24 v3.0 («Illumina», США) с применением сканера iScan согласно протоколу Infinium HTS Assay [10]: FSHR — rs6166, rs6165, rs1394205; LHCGR — rs2293275, rs4073366, rs4953616, rs7579411; ESR1 — rs2234693, rs3020394, rs3798577, rs9340799; ESR2 — rs4986938; PGR — rs1042838. Все этапы генетического анализа, включая экстракцию ДНК, генотипирование и хранение биоматериала, проводились исключительно на территории Российской Федерации. Трансграничная передача генетических данных не осуществлялась, что полностью соответствует требованиям Федерального закона № 86-ФЗ.

Статистический анализ проводили в пакете Statistica 12.5 (StatSoft). Соответствие количественных переменных нормальному закону распределения проверяли критерием Шапиро-Уилка; данные представлены в формате M±SD. Для межгрупповых сравнений количественных признаков использовали t-критерий Стьюдента. Частоты генотипов и аллелей сопоставляли с помощью критерия χ² Пирсона; при ожидаемом числе наблюдений в ячейке менее 5 применяли точный критерий Фишера. Соответствие наблюдаемых частот генотипов равновесию Харди-Вайнберга (HWE) оценивали в группе сравнения методом χ². Силу ассоциаций полиморфных вариантов с исходами ЭКО выражали через отношение шансов (OR) с расчётом 95% доверительного интервала (95% CI). Порогом статистической значимости принято значение p<0,05.

Ввиду ограниченного объёма выборки (n=96) дополнительную верификацию выявленных ассоциаций выполняли с применением пермутационного теста (процедура Монте-Карло, 10 000 перестановок фенотипических меток при фиксированной генотипической структуре). Результат считался статистически значимым при эмпирическом уровне значимости p-perm <0,05.

Результаты

Результаты сравнительного анализа распределения частот генотипов 13 SNP в генах рецепторов гонадотропинов (FSHR, LHCGR) и половых стероидов (ESR1, ESR2, PGR) между пациентками с благоприятным исходом программы ЭКО (группа 1) и женщинами с неэффективными исходом (группа 2) представлены в табл. 1. Распределение частот генотипов изучаемых полиморфизмов соответствовало закону Харди-Вайнберга (p >0,05). Статистически значимые межгрупповые различия были верифицированы для двух локусов гена ESR1: rs2234693 и rs3020394.

Анализ распределения генотипов rs2234693 выявил негативное прогностическое значение гетерозиготного варианта С/Т. Частота данного генотипа в группе с неблагоприятным исходом составила 26 случаев против 16 в группе с успешной имплантацией, что подтвердило достоверную ассоциацию с неэффективностью программы ЭКО (р=0,024; OR=0,593; 95% CI 0,170-0,890).

Высокую предиктивную значимость показал локус rs3020394. Минорный гомозиготный генотип G/G полностью отсутствовал в группе пациенток с наступившей беременностью, но регистрировался у 8 пациенток в группе 2, что указывает на его потенциальную негативную роль (табл. 1). Напротив, генотип А/А достоверно чаще встречался в группе 1, а носители данного генотипа имели в 2,5 раза выше шанс благоприятного исхода ЭКО, чем носители других генотипов (p=0,025).

Для других полиморфизмов ESR1 — rs3798577 и rs9340799 — не обнаружено статистически надежной связи с клиническими исходами (p > 0,05).

Ни один из тестируемых полиморфных вариантов рецепторов гонадотропных гормонов FSHR и LHCGR не показал статистически значимой ассоциации с частотой наступления клинической беременности (p > 0,05). Распределение частот генотипов вариантов rs6165 и rs6166 гена FSHR было практически идентичным у женщин с успешными и неудачными попытками ЭКО (табл. 1). Промоторный полиморфизм rs1394205 продемонстрировал слабую тенденцию к накоплению генотипа C/C в группе 2 (27 случаев против 19), однако различия не достигли уровня статистической значимости (p=0,102).

Частоты встречаемости исследуемых локусов гена LHCGR (rs2293275, rs4073366, rs4953616) не имели достоверных межгрупповых отклонений. В локусе rs7579411 генотип C/С достоверно чаще регистрировался у пациенток с наступившей беременностью, однако пермутационный тест не подтвердил значимость ассоциации с исходом ЭКО (табл. 1).

Исследование генетической вариабельности изоформ ESR2 и PGR не выявило прогностических маркеров среди анализируемых точек. Стоит отметить, что минорный гомозиготный вариант А/А, зафиксированный у 2 пациенток группы 1 и отсутствующий в группе с неудачами имплантации (p=0,247), не может служить изолированным критерием эффективности циклов ВРТ.

Обсуждение

В ходе проведенного исследования была выявлена статистически значимая ассоциация гетерозиготного генотипа С/Т полиморфизма rs2234693 (PvuII) гена ESR1 с неблагоприятным исходом программы ЭКО (p=0,024; OR=0,593; 95% CI 0,170-0,890), что указывает на повышенный риск неудач имплантации и неэффективности циклов ВРТ у данной категории пациенток.

Молекулярно-генетический механизм данного феномена тесно связан с локализацией полиморфизма и его функциональным влиянием на транскрипционную активность гена. Однонуклеотидная замена rs2234693 расположена в первом интроне гена ESR1. Согласно литературным данным, этот участок вовлечен в процессы альтернативного сплайсинга и модулирует итоговый уровень мРНК рецептора эстрогена альфа (ERα) [11, 12]. Замена цитозина на тимин (аллель T) нарушает ключевое регуляторное взаимодействие с транскрипционным фактором B-myb, блокируя энхансерный эффект, что ведет к существенному снижению экспрессии гена ESR1 и дефициту полноценных рецепторов ERα [13]. Можно предположить, что у гетерозиготных носителей (генотип С/Т), в силу присутствия минорного аллеля Т, нарушается стехиометрическое соотношение и плотность ERα-рецепторов на поверхности клеток эндометрия. Даже на фоне адекватного или высокого (в условиях КОС) уровня экзогенных и эндогенных эстрогенов, ткань эндометрия из-за дефицита рецепторов не способна развить адекватный биологический ответ. Таким образом, формируется фенотип относительной «резистентности к эстрогенам».

Кроме того, адекватная экспрессия ERα в пролиферативную фазу менструального цикла критически важна для полноценной пролиферации стромы и эпителия матки, индукции рецепторов к прогестерону и последующей секреторной трансформации [14]. Снижение функциональной активности ERα у носительниц генотипа С/Т приводит к нарушению синхронизации процессов созревания эндометрия. Это смещает или блокирует формирование так называемого «окна имплантации», делая эндометрий функционально незрелым и нерецептивным к моменту переноса эмбриона высокого качества, что и обуславливает высокую частоту неудач.

Помимо маточного фактора, ERα экспрессируется в клетках гранулезы яичников [15]. Субоптимальный уровень экспрессии рецептора у гетерозигот может нарушать локальный эстроген-зависимый сигналинг в процессе КОС, что потенциально сказывается на качестве ооцитов, несмотря на их визуально нормальное морфологическое созревание.

Важным результатом проведенного анализа стало выявление протективной ассоциации генотипа А/А (р=0,025; OR=2,553; 95% CI 1,120-5,820) и негативного прогностического значения гомозиготного генотипа G/G полиморфизма rs3020394 гена ESR1. В узкоспециализированной литературе по репродукции человека этот маркер отдельно упоминается реже, чем классические PvuII (rs2234693) или XbaI. Тем не менее, его роль рассматривается в контексте изменения регуляторной активности гена и системного влияния эстрогенов [16]. SNP в локусе rs3020394 способна оказывать регуляторное влияние на стабильность мРНК гена ESR1 или изменять аффинность промоторных областей к ключевым ядерным факторам транскрипции ввиду локализации в сайте модифицированных гистонов в областях энхансеров и в ДНКазо-гиперчувствительном сайте.

Таким образом, наиболее вероятное объяснение заключается в том, что rs3020394, обладая регуляторным потенциалом, может изменять экспрессию или функцию ERα. Это, в свою очередь, изменяет эстроген-зависимые процессы, критически важные для рецептивности эндометрия и успешной инвазии трофобласта. В условиях КОС, когда уровень эстрадиола в плазме крови многократно превышает физиологические значения, полноценный ответ ткани зависит не от концентрации гормона, а от плотности и реактивности рецепторного аппарата. У носителей генотипа А/А достаточная плотность ERα способствует секреторной трансформации эндометрия под действием прогестерона в лютеиновую фазу, что приводит к синхронизации молекулярно-клеточных процессов, включая созревание пиноподий, экспрессию интегринов и цитокинов, формируя «окно имплантации» и делая эндометрий функционально открытым для качественного эмбриона.

Тот факт, что генотип G/G полиморфизма rs3020394 гена ESR1 встречался исключительно в группе с повторными неудачами ЭКО (8 случаев против 0), подтверждает гипотезу о том, что данный полиморфизм может служить важным «скрытым» маркером дефекта рецептивности эндометрия, который усугубляет риски бесплодия при трубно-перитонеальном факторе. Фармакогенетическое определение данного локуса до вступления в протокол ВРТ позволяет выделить группу сверхвысокого риска по повторным неудачам имплантации и требует разработки индивидуальных патогенетических схем подготовки эндометрия.

Стоит отметить, что подобные ассоциации ранее были описаны и для других полиморфизмов гена ESR1. Например, в исследованиях на корейской популяции комбинации генотипов ESR1 с другими полиморфизмами ассоциировались со сниженным риском повторной неудачи имплантации [7]. Это подтверждает, что генетическая вариабельность ESR1 в целом является важным фактором, влияющим на успех программ ЭКО.

В ходе исследования было установлено, что полиморфизмы генов рецепторов гонадотропинов (FSHR: rs6165, rs6166, rs1394205; LHCGR: rs2293275, rs4073366, rs4953616, rs7579411), а также рецепторов стероидных гормонов (ESR2: rs4986938 и PGR: rs1042838) не продемонстрировали статистически значимой ассоциации с частотой наступления клинической беременности у пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием (p >0,05).

Таким образом, изоляты полиморфизмов генов FSHR, LHCGR, ESR2 и PGR не могут быть использованы в качестве самостоятельных прогностических маркеров клинической эффективности ВРТ у пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием. Вероятно, их изолированное влияние на репродуктивные исходы успешно нивелируется за счёт фармакологического овариального воздействия и персонализации стартовых дозировок экзогенных гонадотропинов в ходе контролируемой овариальной стимуляции, а также стандартной гормональной поддержки лютеиновой фазы. Это подчеркивает уникальную предиктивную значимость локусов rs2234693 и rs3020394 гена ESR1, полиморфизм которых, напротив, ассоциирован со стойкой тканевой резистентностью, не преодолеваемой стандартными терапевтическими дозировками гормонов.

Ограничения исследования

При интерпретации результатов необходимо учитывать два методологических ограничения исследования. Проведение множественных сравнений (13 SNP) на выборке ограниченного объёма потенциально увеличивает вероятность ложноположительных находок; данный риск контролировался посредством пермутационного анализа (10 000 перестановок), и лишь ассоциации, подтверждённые по критерию p-perm, включены в настоящую работу. Кроме того, целенаправленный отбор пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием, сохранным овариальным резервом и европеоидной этнической принадлежностью обусловливает ограниченную обобщаемость выводов применительно к иным нозологическим формам женского бесплодия, различным популяционным группам и пациенткам со сниженным овариальным резервом.

Выводы

Проведенное проспективное пилотное исследование продемонстрировало высокую научно-практическую значимость интеграции методов фармакогенетики в алгоритмы ведения пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием в программах ВРТ. Комплексный анализ 13 SNP позволил выявить потенциальные генетические предикторы исхода ЭКО. Установлено, что генотип А/А rs3020394 гена ESR1 ассоциирован с наступлением клинической беременности, а генотипы G/G rs3020394 и С/Т rs2234693 гена ESR1 ассоциированы с неблагоприятным исходом, и, вероятно, играют важную роль в генезе повторных неудач имплантации.

Выявление неблагоприятных аллельных вариантов гена ESR1 позволяет ещё до вступления пациентки в протокол ВРТ прогнозировать риски повторных неудач имплантации у соматически здоровых женщин с нормальным овариальным резервом. Пациенткам — носительницам генотипов С/Т rs2234693 и G/G rs3020394 гена ESR1 — целесообразно рекомендовать проведение расширенной прегравидарной подготовки, направленной на преодоление тканевой резистентности к эстрогенам, а также рассмотрение вопроса о переносе эмбрионов в модифицированных криопротоколах или на фоне индивидуально подобранных схем заместительной гормональной терапии.