Полиморфизмы генов CYP2C9 и VKORC1 и их ассоциация с кальцинозом клапанов сердца у пациентов–чувашей с хронической ревматической болезнью сердца

Введение

Хроническая ревматическая болезнь сердца (ХРБС) представляет собой патологический процесс, характеризующийся прогрессирующими структурными изменениями сердечных клапанов, возникающими вследствие перенесённой острой ревматической лихорадки. Особенностью данного заболевания являются поствоспалительные краевые фиброзные изменения створок клапанов с развитием деформации и утраты клапанной функции. Морфологические проявления могут включать не только фиброз, но и кальцификацию тканей клапанов сердца (особенно митрального и аортального). В результате таких изменений формируются характерные деформации клапанов: митральный стеноз и/или регургитация, а также аортальный стеноз, что способствует нарушению гемодинамики и существенно ухудшает качество жизни пациентов, нередко требует хирургического вмешательства.

Высокий риск тромбоэмболических осложнений, обусловленный наличием возможных патологических состояний, как фибрилляция предсердий, венозный тромбоз и имплантация искусственных клапанов сердца, обуславливает необходимость назначения антикоагулянтной терапии пациентам с ХРБС. Варфарин остаётся наиболее часто назначаемым антикоагулянтом при ХРБС, а в случае наличия механических клапанов является безальтернативным. Важнейшую роль в эффективности и безопасности терапии варфарином играют генетические вариации, в первую очередь, полиморфизмы генов CYP2C9 и VKORC1. Ген CYP2C9 кодирует фермент цитохрома P450, являющийся ключевым участником метаболизма варфарина. Носительство аллельных вариантов CYP2C9*2 и CYP2C9*3 ассоциировано с уменьшением каталитической активности фермента, что ведёт к замедленному метаболизму варфарина. В результате этого повышается вероятность возникновения кровотечений при стандартных дозировках [1, 2].

Ген VKORC1 кодирует витамин–К–эпоксидредуктазу — мишень варфарина, играющую ключевую роль в восстановлении витамина K. В частности, VKORC1 катализирует редукцию эпоксидной формы витамина K, образующейся в ходе γ–карбоксилирования белков, превращая её в активную гидрохиноновую форму. Благодаря этой функции VKORC1 обеспечивает непрерывность цикла витамина K, что критически важно для посттрансляционной модификации ряда белков, включая не только факторы свёртывания крови, но и Gla-белки матрикса, такие как остеокальцин и MGP. Таким образом, генетические вариации VKORC1 могут оказывать влияние не только на систему коагуляционного гемостаза, но и процессы кальцификации различных тканей [3].

Распространённость аллелей VKORC1 существенно варьирует в этнических группах [4–22]. Эти различия имеют важное клиническое значение, поскольку позволяют предсказывать индивидуальную дозу антикоагулянтов, тем самым минимизировать риск кровотечений. Кроме того, было продемонстрировано, что T–аллель полиморфизма VKORC1 (1173C>T) связан со значительно более высоким риском кальцификации стенки аорты у представителей белой расы [23]. В связи с чем, нами была выдвинута гипотеза о возможной взаимосвязи развития кальцификации сердечных клапанов с носительством полиморфизмов гена VKORC1 (−1639G>A).

По результатам Всероссийской переписи населения за 2020 г. 0,82 % составляет популяция чувашей и занимает пятое место по численности в России [24], однако, сведения о генетическом статусе чувашей ограничены. В связи с вышеизложенным, целью нашего исследования стало изучение полиморфизмов генов СУР2С9 (C430T и A1075C), VKORC1, и их ассоциации с кальцинозом клапанов сердца у пациентов–чувашей с ХРБС. Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1) выявить частоту встречаемости полиморфных аллелей среди пациентов-чувашей с ХРБС; 2) изучить распространённость кальциноза клапанного аппарата среди пациентов-чувашей с ХРБС; 3) изучить ассоциацию носительства полиморфизмов исследуемых генов с кальцинозом клапанов сердца у пациентов-чувашей с ХРБС.

Материалы и методы

Проведено проспективное исследования на базе бюджетного учреждения «Республиканский кардиологический диспансер» Минздрава Чувашии (БУ «РКД» МЗ ЧР) с мая 2023 г. по декабрь 2024 г. В исследование были включены пациенты чувашской популяции, поступившие в стационар с основным диагнозом «ХРБС». Проведение исследования было одобрено локальным этическим комитетом АУ «Республиканский клинический онкологический диспансер» МЗ ЧР (АУ «РКОД», выписка из протокола № 5 от 23.05.2023 г.). От всех пациентов предварительно получено информированное согласие на участие в исследовании, а также на забор и сохранение биоматериала. Этническая принадлежность определялась путём самоотнесения с помощью оценки генеалогии участника исследования в двух и более поколениях, и отсутствия межэтнических браков. Были разработаны критерии включения и исключения из исследования. Критериями включения в исследование явились:

• самоотнесение к этническому чувашу;
• наличие оперированного дегенеративного порока клапана/клапанов сердца или ХРБС;
• терапия варфарином;
• стационарное лечение в БУ «РКД» МЗ ЧР;
• возраст пациентов 18–80 лет.

Критериями исключения явились:

• самоидентификация себя не как пациента чувашской этнической группы;
• хроническая сердечная недостаточность с фракцией выброса менее 30 %;
• хроническая болезнь почек 5 стадии;
• декомпенсированная печёночная недостаточность;
• злокачественное новообразование 3–4 клинической группы с наличием отдалённых метастазов, лимфопролиферативные заболевания;
• септическое состояние пациента / острый инфекционный процесс;
• острые нарушения мозгового кровообращения;
• болезни накопления (в т. ч. амилоидоз);
• возраст старше 80 лет, младше 18 лет;
• дисциркуляторная энцефалопатия 3 степени и/или психические заболевания;
• беременность.

Для выявления кальциноза клапанов сердца у всех пациентов, включённых в исследование, проводили анализ результатов эхокардиографии (ЭхоКГ) и ультразвукового исследования (УЗИ) сердца, проводимых на базе БУ «РКД».

Генотипирование проводили на базе АУ «РКОД». Материалом для определения полиморфизмов послужили 4 мл венозной крови пациента, собранные из локтевой вены в пробирки с этилендиаминтетрауксусной кислотой. В рамках исследования осуществлялось выделение ДНК и определение полиморфизмов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для этого использовался амплификатор «Dtlite» (ООО «НПО ДНК–Технология», Россия) и набор реагентов «ФармакоГенетика Варфарин» (регистрационный номер ФСР 2010/08633 от 01.07.24, ООО «НПО ДНК–Технология», Россия). В комплект входили 48 тестов, Taq–АТ–полимераза, минеральное масло, ПЦР–буфер и пробирки с исследуемыми полиморфизмами — CYP2C9 (C430T и A1075C), VKORC1.

Методика предусматривала одновременное выявление двух аллельных вариантов каждого полиморфизма в одной реакции. Извлечение ДНК выполнялось согласно инструкции к набору реагентов, при этом использовался комплект для выделения нуклеиновых кислот из биологических образцов «ПРОБА–РАПИД–ГЕНЕТИКА» (ООО «НПО ДНК–Технология», Россия). Для каждого полиморфизма подготавливали необходимое число пробирок, которые затем встряхивали с амплификационной смесью и центрифугировали в течение 3 секунд на микроцентрифуге Вортекс. В каждую пробирку добавляли по 20 мкл амплификационной смеси, приготовленной из смеси ПЦР–буфера и ТехноTaq МАХ–АТ полимеразы в соотношении 10 мкл и 0,5 мкл соответственно. После перемешивания смесь центрифугировали. В каждую пробирку добавляли 10 мкл подготовленной ДНК–образца и 20 мкл минерального масла для исключения перекрёстной контаминации, после чего снова центрифугировали. Затем в каждую реакционную пробирку добавляли по 5 мкл ДНК–образца, после чего проводилась повторная центрифугирование. В качестве контроля использовали 5 мкл отрицательного образца. Все пробирки помещали в блок амплификатора «Dtlite», где запускалась программа RealTime PCR, автоматизирующая проведение реакции. В рамках программы осуществлялась начальная денатурация при 95 °C в течение 3 мин., после чего выполнялись 40 циклов: денатурация при 95 °C — 15 секунд и отжиг при 63 °C — 40 секунд. После завершения реакции регистрировались результаты. По итогам исследования для каждого участника составлялось заключение с определением генотипов для полиморфизмов CYP2C9 (C430T и A1075C), VKORC1.

Статистический анализ проводился с использованием программы StatTech v. 4.8.5 (ООО «Статтех», Россия). Количественные показатели оценивались на предмет соответствия нормальному распределению с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Описание количественных признаков в случае нормального распределения представлено в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение (M±SD, в качестве меры репрезентативности для средних значений указывались границы 95 % доверительного интервала (95 % ДИ)), и в виде медианы с указанием 25 и 75 перцентиля (Mе [Q₁; Q₃]) — при распределении отличном от нормального. Сравнение двух групп по количественному показателю, распределение которого отличалось от нормального, выполнялось с помощью U-критерия Манна–Уитни, а Сравнение трёх и более групп — с помощью критерия Краскела–Уоллиса. Сравнение процентных долей при анализе четырёхпольных таблиц сопряжённости выполнялось с помощью точного критерия Фишера. В качестве количественной меры эффекта при сравнении относительных показателей рассчитывалось отношение шансов с 95 % доверительным интервалом (ОШ; 95 % ДИ). Сравнение процентных долей при анализе многопольных таблиц сопряжённости выполнялось с помощью критерия хи-квадрат Пирсона. Апостериорные сравнения выполнялись с помощью критерия хи-квадрат Пирсона с поправкой Холма.

Результаты

В исследование включены 74 пациента чувашской национальности с ХРБС, наблюдавшихся в БУ «РКД» г. Чебоксары в период с мая 2023 г. по февраль 2024 г. Средний возраст участников исследования составил 66,4 лет (Q1–Q3: 62,00–70,75 лет). Большинство пациентов были женского пола, их доля достигала 62,2 % (n=46). В качестве сопутствующей патологии у всех обследованных была выявлена гипертоническая болезнь и хроническая сердечная недостаточность, более 70 % имели фибрилляцию предсердий и гиперлипидемию. Механические протезы одного или нескольких сердечных клапанов имели более 75 % пациентов [25]. Часто выявлялся стеноз митрального клапана — у 77 % обследованных, стеноз аортального клапана диагностирован у 59,5 %, а стеноз трёхстворчатого клапана — у 18,9 %. Практически у всех участников исследования встречался кальциноз или утолщение клапанов сердца (табл. 1), нередко фиксировались поражения сразу нескольких клапанов.

Таблица 1

Частота встречаемости кальциноза клапанного аппарата сердца у исследуемых пациентов–чувашей с хронической ревматической болезнью сердца (n=74)

Полученные результаты фармакогенетического тестирования (табл. 2) соответствовали ожидаемым по уравнению Харди–Вайнберга, p >0,05 (CYP2C9*2: χ²=0,941, p=0,332; CYP2C9*3: χ²=0,132, p=0,716; VKORC1: χ²=0,51, p=0,821; CYP4F2: χ²=0,560, p=0,454), что свидетельствует о том, что распределение частоты генотипов в данной выборке пациентов отражает их распределение в популяции.

Таблица 2

Носительство полиморфизмов генов у пациентов–чувашей с хронической ревматической болезнью сердца (n=74)

В рамках проведённого фармакогенотипирования по гену VKORC1 (–1639_G>A, rs9923231) доминировал гетерозиготный вариант GA, встречавшийся у 48,6 % исследуемых (n=36), в то время как гомозиготный аллель AA был обнаружен у 24,3 % (n=18), а «дикий» ген — у 27 % (n=20). Таким образом, частота аллеля А по этому гену составила 48,6 % среди пациентов-чувашей с ХРБС.

При исследовании носительства вариантов CYP2C9*2 (430 C>T, rs1799853) выяснилось, что у 79,7 % (n=59) пациентов отсутствовали полиморфные варианты, а у 20,3 % (n=15) выявлены гетерозиготные формы СТ. Аналогично, при анализе варианта CYP2C9*3 (A>C, rs1057910) более чем у 91,9 % (n=68) пациентов фиксировали «дикий» ген, тогда как гетерозиготный вариант АС был обнаружен у 8,1 % (n=6). Следует отметить, что гомозиготных полиморфизмов по этим двум генам выявлено не было.

Дальнейший анализ включал изучение возможных ассоциаций между наличием полиморфных аллелей изучаемых генов и сопутствующими заболеваниями, такими как ишемическая болезнь сердца, гипертоническая болезнь, хроническая сердечная недостаточность, фибрилляция предсердий и экстрасистолия. Статистически значимых связей обнаружено не было. Внимание привлекла ассоциация между носительством полиморфизма гена VKORC1 и наличия кальциноза сердечных клапанов у пациентов-чувашей с ХРБС. Так, достоверно чаще (р=0,014, p_AA–GA=0,030) встречался кальциноз клапанного аппарата у гомозиготных носителей аллеля А, чем у гетерозиготных или при отсутствии аллеля А (рис. 1).

Рис. 1. Связь гомозиготного носительства аллеля АА VKORC1 (−1639G>A) и кальциноза клапанов сердца у пациентов–чувашей с ХРБС (n=74)

В дальнейшем более подробное изучение продемонстрировало наличие связи гомозиготного носительства аллеля АА VKORC1 (−1639G>A) с кальцинозом аортального клапана (р=0,023, p_AA–GA=0,021), но не митрального клапана (р=0,030, p_GG–GA=0,025), тогда как достоверных ассоциаций с кальцинозом трёхстворчатого клапана выявлено не было (р=0,860) (рис. 2).

Рис. 2. Связь носительства полиморфизмов гена VKORC1 (−1639G>A) и кальциноза аортального клапанов сердца (р=0,023, p_AA–GA=0,021) у пациентов–чувашей с ХРБС (n=74). 

Сокращение: кальцин АК — кальциноз аортального клапана.

Обсуждение

Проведено проспективное исследование, которое включило 74 пациента чувашского этноса с диагнозом ХРБС, по гендерному составу превалировали женщины. Несмотря на то, что у 24,3 % пациентов протезы клапанов отсутствовали, все пациенты имели показания к антикоагулянтной терапии и получали варфарин в связи с риском тромбоза.

Хорошо известно, что чувствительность к варфарину в значительной степени связана с полиморфизмами генов VKORC1 и CYP2C9, носительство которых имеют этнические и географические различия [5–23]. Литературные данные свидетельствуют о том, что минорный аллель А полиморфного варианта гена VKORC1 (−1639G>A) очень часто (более 90 % населения) выявляется в Японии и Китае (династия Хань) [4–7], и, наоборот сравнительно редко встречается среди населения чернокожих американцев и индейцев [21].

В настоящем исследовании полиморфизмы гена VKORC1 (−1639G>A) среди пациентов-чувашей с ХРБС встречались нередко. Результаты анализа продемонстрировали, что гетерозиготный статус GA встречался у половины участников (48,6 %), гомозиготная форма AA — у 18 %, а «дикий» вариант — у 27 %. В целом, частота минорного аллеля А гена VKORC1 в чувашской популяции составила 48,6 %, что сопоставимо с данными для населения Аргентины, Сирии, Египта, Турции и Италии [9, 10, 13, 16, 19], где частота встречаемости А аллеля составила от 47 до 56 %.

Среди генетических факторов, повышающих чувствительность к варфарину, также большое клиническое значение имеет носительство генетических вариантов CYP2C9. В рамках проведённого генотипирования на носительство CYP2C9*2 и CYP2C9*3 у пациентов-чувашей с ХРБС продемонстрировано доминирование «диких» вариантов генов — 79,7 и 91,9 % над полиморфными, при этом гомозиготных полиморфизмов выявлено не было.

Отметим, что все пациенты-чуваши с ХРБС, включенные в исследование, получали антикоагулянт варфарин. Фармакодинамика этого антикоагулянта направлена на ингибирование фермента VKORC1. Таким образом, варфарин препятствует посттрансляционной модификации различных белков, зависимых от витамина К: может нарушать активацию не только факторов свертывания в печени, но и матриксного Gla-белка (MGP), который является мощным ингибитором кальцификации сосудов [23]. С одной стороны носительство полиморфизмов VKORC1 повышает антикоагулянтный эффект варфарина, но с другой стороны возможно предположить, что это может быть фактором развитием кальциноза как сосудов эластического типа, так и связанными с ними клапанами сердца, которые поражаются при ХРБС.

Данные, полученные в ряде экспериментальных и клинических исследований, свидетельствуют, что снижение активности фермента VKORC1, может влиять на процессы кальцификации стенок сосудов. Например, исследование на крысах показало, что применение варфарина вызывает значительное увеличение концентрации кальция в тканях сосудов эластического типа, включая аорту [26]. При этом диета богатая витамином K1 замедляла прогрессирования кальциноза. Генетически обусловленное снижение активности VKORC1 также ассоциировалось с кальцификацией сосудов. Так, выявлена ассоциация между наличием полиморфного T–аллеля VKORC1 (1173 C>T) и повышенным риском кальцификации аорты у представителей европеоидной расы [13]. Носители этого аллеля демонстрировали на 19% более высокий риск развития кальциноза по сравнению с носителями «дикого» типа. Патогенетически это может быть связано с ингибированием образования активного MGP, способствует накоплению кальция в стенках сосудов и клапанах, что клинически проявляется в развитии кальциноза [25–28].

Практически все обследованные нами пациенты-чуваши с ХРБС имели признаки кальциноза и/или утолщения сердечных клапанов по результатам ЭхоКГ и УЗИ. В связи с этим был проведён анализ взаимосвязи носительства полиморфных вариантов изучаемых генов с наличием кальциноза клапанов сердца. Статистически значимая ассоциация кальциноза клапанов была выявлена с исследуемым полиморфизмом VKORC1, но не CYP2C9. В рамках проведенного исследования нами выявлена значимая связь между носительством гомозиготного полиморфизма гена VKORC1 (G1639А) и кальцинозов клапанов сердца, а также кальцинозом аортального клапана, но не других клапанов по отдельности.

Таким образом, наши данные могут свидетельствовать, что генетически обусловленное снижение активности VKORC1 может быть связано с повышенным риском кальциноза клапанов (преимущественно аортального) у пациентов, принимающих варфарин. Эти результаты дополнительно подчеркивают важность учета генетических и фармакологических факторов при клинической оценке сосудистых кальцинатов и могут иметь значение для разработки индивидуализированных стратегий антикоагулянтной терапии пациентов с ХРБС.

Ограничения исследования

Мощность настоящего исследования следует признать недостаточной. Однако несмотря на то, что в исследовании приняли участие лишь 74 пациента, результаты фармакогенетического тестирования соответствовали ожидаемым по уравнению Харди–Вайнберга, что свидетельствует о возможной экстраполяции выводов на популяцию.

Основные выводы

1. Среди пациентов чувашской популяции с ХРБС частота встречаемости аллеля А полиморфного гена VKORC1 (−1639G>A) составила 48,60 %, аллеля Т CYP2C9*2 — 10,15 % и аллеля С CYP2C9*3 — 4,05 %. Гомозиготные полиморфизмы CYP2C9*2 и CYP2C9*3 среди пациентов–чувашей с ХРБС выявлены не были.
2. У 75,7 % пациентов с ХРБС был диагностирован кальциноз какого-либо сердечного клапана, чаще всего встречался кальциноз аортального (50 %) и митрального (45,9 %), реже — трёхстворчатого (4,1 %) клапана.
3. Среди гомозиготных носителей аллеля А гена VKORC1 (−1639G>A) пациентов чувашского этноса с ХРБС чаще наблюдаются кальциноз клапанов сердца. Выявлена достоверная связь между гомозиготным носительством минорного аллеля А гена VKORC1 (−1639G>A) и кальцинозом аортального клапана сердца (р=0,023, p_AA–GA=0,021).