Перспективы фармакотранскриптомики в понимании эффектов противоэпилептических препаратов и поиске новых классов противоэпилептических препаратов

Введение

Эпилепсия является генетически и клинически неоднородным распространённым социально значимым заболеванием, поражающим все возрастные группы населения. Эпилепсией страдают около 1–2 % населения в мире [1]. Оно характеризуется повторяющимися неспровоцированными приступами, вызванными дисбалансом между возбуждением и торможением в нейронных цепях. Это заболевание требует длительного приёма противоэпилептических препаратов (ПЭП), в ряде случаев пожизненного [1]. Длительный приём ПЭП, высокие дозы ПЭП, политерапия ПЭП ассоциированы с высоким риском развития нежелательных реакций (НР), включая тератогенность [2], нейротоксичность [3], кардиотоксичность [4], метаболический синдром [5, 6] и др., а также с развитием терапевтической резистентности с неэффективным контролем эпилептических приступов у значительной части пациентов. Фармакометаболомика (терапевтический лекарственный мониторинг (ТЛМ) ПЭП, газожидкостная хроматография с масс-спектрометрией (ГЖХ-МС) активных метаболитов ПЭП) и фармакогеномика (фармакогенетическое тестирования нефункциональных полиморфизмов генов, кодирующих ключевые ферменты метаболизма и транспорта ПЭП) активно развиваются и относятся к приоритетным направлениям персонализированной неврологии [7]. Несмотря на растущий интерес исследователей к взаимосвязи между эпигенетическими биомаркерами и эффективностью или безопасностью фармакотерапии эпилепсии, влияющими на риск развития ПЭП-индуцированных НР, подходы, основанные на фармакотранскриптомике [8], пока находятся в зачаточном состоянии и в реальной клинической практике эпилептолога не применяются. Успех мультиомического подхода (фармакометаболомики, фармакогеномики и фармакотранскриптомики) к фармакотерапии эпилепсии во многом будет зависеть от критериев, используемых для отбора методов исследования ПЭП и их активных метаболитов в биологических жидкостях (плазма, сыворотка, слюна, моча, волосы), фармакогенетических панелей для идентификации полиморфизмов (вариантов) генов-кандидатов, кодирующих пути метаболизма и транспорта ПЭП, а также эпигенетических биомаркеров (в первую очередь, микроРНК, влияющих на изменение экспрессии генов (транскриптом) пациента в ответ на воздействие ПЭП (дозу, длительность приёма, и т. д.), особенно при их длительном приёме. Выявление перспективных эпигенетических биомаркеров повысит шансы на успех в исследованиях ассоциаций на основе микроРНК, а также в перспективе позволить разработать новый класс лекарственных средств (ЛС) для пациентов с терапевтически резистентной эпилепсией.

Фармакотранскриптомика и эпигенетические биомаркеры противоэпилептических препаратов

Фармакотранскриптомика — это новая область исследований, которая только начала развиваться и обещает помочь в поиске мишеней, определении эпигенетических биомаркеров и оценке эффективности ПЭП [9], выходящей за рамки фармакогеномики и фармакометаболомики [10]. К основным направлениям исследований в области фармакотранскриптомики ПЭП можно отнести следующие:

• определение механизмов действия ПЭП:
  1. секвенирование РНК (RNA-seq2) для анализа всего транскриптома (всех молекул РНК) в клетках или тканях, подвергшихся воздействию ПЭП, что позволяет определить, какие гены активируются ПЭП, а какие –– нет);
  2. исследование генов-концентраторов (hub-genes) и путей их прохождения для идентификации генов, которые играют центральную роль в ПЭП-индуцированных изменениях экспрессии генов, и путей, в которых они участвуют;
• открытие новых ПЭП:
  1. перепрофилирование ЛС, когда в результате чего транскриптомных данных идентифицируются ЛС, изменяющие транскриптомную характеристику эпилепсии, включая достижение свободы от эпилептических приступов; перепрофилирование ЛС на основе фармакотранскриптомики помогает найти новые классы ЛС с потенциальным противоэпилептическим эффектом;
• персонализированная неврология/эпилептология:
  1. прогнозирование реакции на ПЭП (эффективности и безопасности), когда анализ результатов исследования транскриптома пациентов с эпилепсией может помочь в разработке прогностических моделей, позволяющих определить, какие ПЭП с наибольшей вероятностью будут эффективны для конкретного человека и какие могут привести к развитию клинически значимых НР (тератогенезу, нейротоксичности, кардиотоксичности, метаболическому синдрому);
• понимание патофизиологии эпилепсии путём, когда транскриптомные исследования могут выявить молекулярные пути, участвующие в патогенезе, прогрессировании эпилепсии и развитии терапевтической резистентности к ПЭП, что потенциально может привести к выявлению новых лекарственных мишеней [11].

Механизм действия ПЭП связан с их воздействием на различные молекулярные мишени, которые избирательно снижают возбудимость нейронов и обеспечивают адекватный контроль над эпилептическими приступами. ПЭП первой и новых генераций имеют различные механизмы действия, которые условно можно разделить на две группы в зависимости от регулирующих функций в отношении потенциал-зависимых ионных каналов и синаптической возбудимости [12]. Однако исследования последних лет убедительно демонстрируют, что ПЭП и их активные метаболиты могут оказывать регулирующее воздействие на экспрессию генов как эпигенетические модификаторы [13].

Эпигенетические модификации и регуляторы представляют собой потенциальные молекулярные элементы, которые контролируют соответствующие физиологические и патологические процессы, тем самым влияя на естественное течение эпилепсии и ответ на ПЭП у конкретного человека. Эти эпигенетические модуляторы можно использовать в качестве биомаркеров эффективности и безопасности ПЭП, потому что они обладают рядом преимуществ и предоставляют информацию о функциях генов, тем самым объясняя различия между эндофенотипами отдельных пациентов, страдающих эпилепсией. Технологии фармакотранскриптомики, используемые для анализа эпигенетических биомаркеров, разрабатываются и совершенствуются, становясь более простыми и доступными в использовании [9, 11, 13].

В 2017 г. García-Giménez et al. [8] предложили модифицированное определение эпигенетического биомаркера как любой эпигенетической метки или изменённого эпигенетического механизма, который: 1) стабилен и воспроизводим при обработке образцов и может быть измерен в биологических жидкостях или первичных типах тканевых препаратов (свежих, замороженных и фиксированных формалином и залитых парафином); 2) предсказывает риск развития заболевания в будущем (риск); 3) определяет заболевание (диагностика); 4) выявляет информацию о естественном течении болезни; 5) прогнозирует исход болезни (прогноз); 6) реагирует на терапию (предикция); 6) отслеживает реакцию на терапию или лекарства (мониторинг терапии); 7) позволяет одновременно проводить диагностику и целенаправленную терапию (терагноз).

Преимущества фармакотранскриптомики над фармакометаболомикой и фармакогеномикой в эпилептологии объясняется тем, что эпигенетические биомаркеры: 1) могут предоставить важную информацию о функции генов в отдельных типах клеток, заполняя клинические пробелы и показывая, в какой степени контролируются конкретные генетические программы; 2) могут включать информацию об окружающей среде и могут включать информацию об образе жизни пациента, страдающего эпилепсией, тем самым объясняя, например, как питание и метаболические факторы влияют на здоровье пациента и течение заболевания; 3) могут предоставлять информацию о естественной истории эпилепсии, являясь настоящими биоархивами; 4) широкий спектр эпигенетических биомаркеров (в частности, микроРНК и посттрансляционные модификации гистонов) чрезвычайно стабильны в жидкостях (например, плазме, сыворотке, моче, слюне, и др.) и большинство из них также чрезвычайно стабильны в основных типах тканевых препаратов (например, свежих и замороженных тканях, пятнах засохшей крови (карты Гатри), залитых парафином образцах тканей и др.); 5) микроРНК являются очень стабильными молекулами даже в образцах низкого качества; 6) могут предоставлять ценную информацию о диагностике заболеваний, прогнозировании и мониторинге лечения; 7) могут обеспечивать одновременную диагностику и таргетную терапию, тем самым способствуя терагнозу [8].

К значимым эпигенетическим биомаркерам относятся метилирование ДНК, модификации гистоновых белков и функции некодирующих РНК.

Бесклеточная циркулирующая ДНК (бцДНК) предложена как эпигенетический биомаркер при различных патологических состояниях [8, 9] и потенциально может быть использована в эпилептологии. Количество бцДНК у здоровых людей, как правило, очень низкое (менее 5 нг/мл в плазме) и может увеличиваться в 8–10 раз у людей с некоторыми формами эпилепсии. Ограничения клинического использования бцДНК заключаются в том, что существует проблема с их выделением из биологических жидкостей и количественной оценкой из-за небольшого количества и фрагментированной природы бцДНК в доступных биообразцах. Кроме того, этап экстракции и очистки имеет решающее значение для разработки воспроизводимых, стандартизированных методов выделения бцДНК, включая контроль качества для измерения эффективности экстракции, смещения размера фрагментов и выхода [14].

Гистоновые белки. Использование гистоновых белков в качестве эпигенетических биомаркеров заболеваний основано на анализе посттрансляционных модификаций гистонов и их вариаций в контексте заболевания и исследования гистонов во внеклеточной среде (в крови). В последнем случае анализ посттрансляционных модификаций гистоновых белков является ценным инструментом для диагностики и/или прогнозирования развития заболевания [8, 9]. Большинство наборов предназначены для быстрого выделения основных гистоновых белков с помощью простых манипуляций, обеспечивающих приемлемый выход, хотя и не исключающих одновременное выделение других ядерных белков. Основным применением является функциональный анализ, выполняемый с помощью вестерн-блоттинга. Однако, использование гистоновых белков в исследованиях эпигенетической регуляции далеко от применения в качестве эпигенетических биомаркеров клинического значения, например при оценке эффективности и безопасности ПЭП. Ограничением также являются проблемы, лежащие в основе методов выделения гистоновых белков с загрязнением другими ядерными белками и компонентами. Большинство наборов и методов очистки требуют высокой плотности клеток, которые могут быть получены путём гомогенизации тканей или выделения клеток крови. Пока мало доступных методов очистки гистоновых белков от биологических жидкостей [11, 13].

Известно, что модификации гистоновых белков влияют на транскрипцию и другие функции ДНК как матрицы [13]. Этот процесс регулируется специфическими ферментативными механизмами, в которых метаболиты выступают в качестве косубстратов или активаторов/ингибиторов. Одним из наиболее распространённых способов модификации гистоновых белков является ацетилирование, нейтрализующее положительно заряженные остатки лизина, которых много в гистоновых белках, тем самым «открывая» хроматин и делая ДНК более доступной для других белковых факторов [15]. Статус ацетилирования гистонов регулируется балансом между активностью гистоновых ацетилтрансфераз и гистоновых деацетилаз (HDAC). Ингибирование HDAC вызывает накопление ацетилированных форм гистоновых белков, таким образом регулируя экспрессию генов, клеточную пролиферацию и клеточную гибель. Некоторые ПЭП могут действовать как ингибиторы HDAC и играть решающую роль во множестве механизмов экспрессии генов. Например, вальпроевая кислота (ВК) является первым известным ПЭП, неселективно ингибирующим HDAC [16, 17]. Позднее показано, что карбамазепин (КМЗ), топирамат (TПM), лакосамид (ЛКМ) также являются ингибиторами HDAC [18, 19]. Леветирацетам (ЛЕВ) не может напрямую влиять на активность HDAC, но 2-пирролидинон-н-масляная кислота (основной метаболит ЛЕВ) способствует деацетилированию гистоновых белков в клетках HeLa [34].

Циркулирующие микроРНК. МикроРНК также можно обнаружить в биологических жидкостях или при жидкостной биопсии, и поскольку некоторые из них демонстрируют изменённый уровень у пациентов с различными клиническими формами эпилепсией [20], в последние годы увеличилось число исследований, демонстрирующих перспективу их использования в качестве эпигенетических биомаркеров терапевтической резистентности к ПЭП и развития НР (например, ПЭП-индуцированного метаболического синдрома [6]). В зависимости от используемого протокола лабораторной диагностики можно выделить: свободные циркулирующие микроРНК; микроРНК, связанные с белками; микроРНК, ассоциированные с микровезикулами; все микроРНК, присутствующие в образце крови. Однако, ограничением использования циркулирующих микроРНК как эпигенетических биомаркеров является более низкая эффективность и выход их из плазмы крови и сыворотки по сравнению с выделением микроРНК из клеток и тканей [21].

Аномальная экспрессия микроРНК может привести к аномальной экспрессии белков, и эти непреднамеренные реакции могут быть вызваны ПЭП. Например, пренатальное воздействие ВК приводит к гиперэкспрессии miR-132 в головном мозге мышиного эмбриона, а затем снижает уровень её молекулярных мишеней — метил-CpG-связывающего белка 2 (MECP2) и белка, активирующего Rho-ГТФазу (p250GAP), что может привести к аутистическому поведению и патологическим изменениям в коре головного мозга мыши [22]. Фенобарбитал (ФБ) может вызывать изменения в уровнях экспрессии гена, кодирующего дельта-подобный гомолог 1, и гена, кодирующего фермент дейодиназы 3 типа (Dlk1-Dio3), которые способны экспрессировать кластеры микроРНК, в результате чего развивается гипертрофия и перекодирование гепатоцитов, повышая риск развития ФБ-индуцированного рака печени у грызунов [23]. КМЗ-индуцированная дерматотоксичность (в частности, синдром Стивенса-Джонсона) связана с нарушением регуляции микроРНК в экспериментальном анализе иммунных клеток [24].

Обсуждение

Исследования последних лет показали, что ПЭП могут: изменять метилирование ДНК; влиять на модификацию гистоновых белков, воздействуя на такие ферменты, как ДНК-метилтрансферазы, гистондеацетилазы и метилсвязывающие белки; изменять уровень экспрессии микроРНК [25]. В связи с этим, бцДНК, модифицированные гистоновые белки и циркулирующие микроРНК могут рассматриваться как перспективные эпигенетические биомаркеры эффективности и безопасности ПЭП, которые влияют на экспрессию генов-мишеней действия ПЭП. Это объясняет прогностическую, профилактическую, диагностическую и терапевтическую роль фармакотранскриптомики на основе вышеуказанных биомаркеров при эпилепсии, терапевтической резистентности к ПЭП и ПЭП-индуцированных НР [26, 27], наряду с фармакогеномикой [7, 28, 29] и фармакометаболомикой [10, 17].

Так, показано, что ВК-индуцированная гепатотоксичность с развитием неалкогольной жировой болезни печени ассоциирована с метилированием ДНК и изменением регуляции генов PPARγ, PPARα, AHR и CD36 [30], а ВК-индуцированное нарушение обмена фолиевой кислоты –– с метилированием ДНК и изменением регуляции гена MTHFR [2, 31]. На животных моделях (грызунах) показано, что ВК-индуцированная гиперэкспрессия miR-132 и miR-134-5p ассоциирована с развитием расстройств аутического спектра [22, 32]. ФБ-индуцированное нарушение ацетилирования и метилирования гистондеацетилазы Н3 влияет на метаболизм этого ЛС [33], а гиперэкспрессия miR-200b и miR-221 ассоциирована с ФБ-индуцированным канцерогенезом [34]. КМЗ-индуцированное нарушение ацетилирование гистоновых белков изменяет регуляцию гена CYP3A4, в результате чего замедляется метаболизм этого ЛС [35], а КМЗ-индуцированная гиперэкспрессия miR-155, miR-18a и miR-21 ассоциирована с дерматотоксичностью [24]. ПЭП-индуцированная нейротоксичность, особенно в отношении головного мозга плода у беременных женщин, страдающих эпилепсией, объясняется множеством механизмов патогенеза, включая нарушение метаболизма фолатов и изменение экспрессии плацентарных белков-переносчиков [2, 36]. В перспективе, фармакотранскриптомика может помочь разработать новые стратегии прогнозирования, профилактики и коррекции этих НР [37, 38].

Фармакотранскриптомика помогает изменить наше понимание механизмов действия ПЭП. Так, ВК увеличивает метилирование локуса -39C в промоторе гена SCN3A и может повышать уровень жировой массы и белка, ассоциированного с ожирением (FTO), который в свою очередь ингибирует экспрессию генов MBD2 и NaV1.3, что даёт новое объяснение механизму противосудорожного эффекта этого ЛС [39]. Противосудорожный эффект этосуксимида ассоциирован с гиперэкспрессией мРНК гена DNMT в коре головного мозга в эксперименте на примере животной модели эпилепсии (крысы) [40].

Кроме того, результаты исследований в области фармакотранскриптомики приводят к лекарственному перепрофилированию ПЭП. Например, молекулярные эффекты ВК включают метилирование ДНК, ацетилирование гистоновых белков и гистондеацетилазы Н3 и Н4 типов [41, 42], изменение экспрессии микроРНК (hsa-miR-124, hsa-miR-125a, hsa-miR-125b, hsa-miR-133b, hsa-miR-145-5p, hsa-miR-205) [43, 44, 45]. В результате ВК-индуцированного метилирования ДНК изменяется регуляция различных генов и их путей (например, BRD1, CD133, NANOG, NGN1, OCT4, SCN3A, SOX2, и др.), что обеспечивает перепрофилирование ВК из противосудорожного и нормотимического в противоопухолевое и иммуномодулирующее ЛС [46].

Молекулярные эффекты КМЗ и ЛЕВ включают метилирование ДНК, ацетилирование гистоновых белков и гистондеацетилазы Н3 типа [13, 33, 37, 47]. Показано, что в результате КМЗ-индуцированного метилирования ДНК изменяется регуляция гена BRD1 [13]. Приём ВК и КМЗ может вызвать активацию транскрипции гена BRD1, ассоциированного с предрасположенностью к шизофрении, за счёт деметилирования промотора этого гена, что делает BRD1 новой мишенью для этих ЛС их использования при лечении расстройств шизофренического спектра [48].

Молекулярные эффекты лакосамида включают ацетилирование гистоновых белков и изменение экспрессии микроРНК [49]. Лакосамид и бриварацетам снижают экспрессию hsa-miR-107 и повышают экспрессию hsa-miR-195-5p, что объясняет их противоопухолевый эффект [50]. Окскарбазепин-индуцированное метилирование ДНК приводит к изменению регуляции гена GABRB2, за счёт чего достигается психотропный эффект [51]. Ламотриджин влияет на ацетилирование гистоновых белков [33], а этосуксимид –– на метилирование ДНК, изменяя регуляцию генов DNMT1 и DNMT3 [38]. В эксперименте с использованием животных моделей показано, что каннабидиол влияет на метилирование ДНК, изменяя регуляцию гена CB1 и митохондриального ферритина, что обеспечивает его психотропный и нейропротекторный эффекты [52, 53].

В последние годы фармацевтическая отрасль сталкивается со снижением эффективности исследований и новых разработок в области эпилептологии, что приводит к тому, что на рынок выходит всё меньше ПЭП, несмотря на увеличение инвестиций. Это обусловлено тем, что некоторые ПЭП-кандидаты не проходят поздние стадии разработки из-за проблем с безопасностью и/или ранее не выявленных НР. Проект OSTAR продемонстрировал, что фармакотранскриптомика путём профилирования экспрессии генов позволяет выявлять НР соединений и является ценным инструментом для принятия решений на ранних стадиях разработки новых ПЭП [54]. Секвенирование одноклеточной РНК (scRNA-Seq) в сочетании с параллельными системами на основе CRISPR, также известными как Perturb-seq, CRISP-Seq и CROP-seq, может помочь в разработке новых ПЭП [55]. Этот подход позволяет проводить скрининг генов, участвующих в терапевтической резистентности к ПЭП или специфической клеточной мишени, сочетая разрешение метода massively parallel scRNA-Seq с масштабом редактирования генома при объединённом скрининге CRISPR, что даёт функциональную информацию о влиянии конкретного генетического нарушения на измеряемый фенотип эпилепсии у конкретного пациента [56, 57].

Исследование Lin WH et al. [58] продемонстрировало, что скрининг с использованием РНК-интерференции может помочь идентифицировать новые мишени для ПЭП нового поколения на основе повышенной экспрессии гомеостатического регулятора pumilio (Pum). Известно, что активность Pum регулируется деполяризацией нейронов головного мозга. При этом, усиленное синаптическое возбуждение повышает экспрессию Pum и усиливает трансляционную репрессию транскриптов потенциал-зависимых натриевых каналов (Nav), что достаточно для ингибирования ионного ток Na+ в нейронах (INa) и снижения частоты генерации потенциала действия и эпилептических приступов в итоге.

Wang L et al. [59] показали, что miR-139-5p повышает чувствительность к ПЭП при терапевтически резистентной эпилепсии за счёт ингибирования белка 1, ассоциированного с множественной лекарственной устойчивостью (MRP1). Кроме того, уровень экспрессии miR-139-5 влияет на развитие коры головного мозга, при этом гиперэкспрессия miR-139-5p может ослаблять повреждения коры головного мозга за счёт регулирующего влияния на миграцию корковых посредством воздействия на Lis1 [60]. Агонисты miR-139-5p (ago-miR-139-5p) ослабляют повреждения у пациентов с эпилепсией путём ингибирования трансформирующего фактора роста человека [59]. Таким образом, новый класс ПЭП, повышающий экспрессию miR-139-5p, может предотвратить дальнейшее развитие эпилепсии и снизить риск развития терапевтической устойчивости к ПЭП.

Заключение

Знание о вариантах транскриптома и их влиянии в контексте молекулярных изменений, вызывающих эпигенетическую модификацию течения эпилепсии и индивидуального ответа на ПЭП у пациентов, страдающих эпилепсией, с использованием неинтегрированных технологий может помочь снизить риск развития терапевтической резистентности к ПЭП и серьёзных НР. Многогранность эпилепсии как генетически и клинически гетерогенного заболевания и её субклеточная гетерогенность играют решающую роль в эффективности и безопасности ПЭП, терапевтической устойчивости к ним и их токсичности. Фармакотранскриптомика является мощным инструментом для понимания молекулярных механизмов действия ПЭП, открытия новых классов ПЭП на основе микроРНК и развития персонализированной медицины, обеспечивающей достижение оптимального баланса между эффективностью и безопасностью фармакотерапии эпилепсии.