Сравнительная оценка влияния носительства полиморфизма генов CYP2C19, CYP2C9, CYP4F2 на клинико-лабораторные особенности пациентов с острым коронарным синдромом

Введение / Introduction

В настоящее время острый коронарный синдром (ОКС) является одной из наиболее распространённых причин госпитализации и смертности среди пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями по всему миру [1]. Хирургическое вмешательство в виде чрескожного коронарного вмешательства (ЧКВ) является эффективным методом лечения ОКС, позволяя улучшить качество жизни и увеличить выживаемость пациентов [2]. Пациентам после проведения ЧКВ назначается двойная антиагрегантная терапия (ДАТ) с целью предупредить риск возникновения тромбоза стента. Клопидогрел на ряду с остальными антиагрегантными средствами по-прежнему является часто назначаемым антиагрегантом в составе ДАТ.

До госпитализации у пациентов с ОКС приём ДАТ не влияет на активность факторов свертывания крови, но способствует снижению агрегации тромбоцитов, которые повышают свою активность в первые сутки развития ОКС. У пациентов с ОКС замедлены процессы антитромбоцитарной активности эндотелия сосудов, и повышена чувствительность тромбоцитов к индукторам агрегации. В первые сутки развития ОКС происходит внутрисосудистая агрегация тромбоцитов, усиление высвобождения факторов свертывания тромбоцитов и фактора Виллебранда, который является носителем прокоагулянтного фактора VII [3].

В настоящее время установлено, что наиболее значимую роль в процессе формирования активного метаболита клопидогрела играет изофермент P-450 CYP2C19, в то время как другие изоферменты, такие как CYP2B6, CYP1A2, CYP3A4, CYP3A5, CYP2C9, CYP4F2, участвуют в этом процессе в меньшей степени [4–8]. Активность вышеупомянутых ферментов генетически детерминирована. Среди них, наиболее исследована связь между наличием минорных аллелей гена CYP2C19*2 и *3 и развитием лабораторной и клинической резистентности к клопидогрелу. Носительство полиморфных аллелей генов, участвующих в метаболизме клопидогрела, является не модифицируемым фактором, который оказывает влияние на эффективность данного препарата.

Тромбоциты являются уникальными клетками крови, обеспечивающими гемостаз. Структурно тромбоцит состоит из трёх зон: периферической, золя-геля и внутриклеточных органелл [9]. Периферическая зона содержит плазматические факторы свертывания, ферменты и рецепторы, необходимые для активации тромбоцитов, их адгезии и агрегации. Мембрана тромбоцитов содержит фосфолипидную матрицу, создающую активные коагуляционные комплексы с плазменными факторами свёртывания крови, а также фосфолипазу А2, способствующую синтезу простагландинов из арахидоновой кислоты. Метаболиты простагландинов формируют тромбоксан А2, вызывающий агрегацию тромбоцитов при повреждении эндотелия сосудов во время острого сердечно-сосудистого события. Фосфолипаза А2 также контактирует с фактором Виллебранда, адгезирующимся к субэндотелию в зоне повреждения [10]. Гликопротеины I, II и III, находящиеся в фосфолипидном слое мембраны тромбоцитов, играют важную роль в процессе агрегации и ретракции сгустка тромбоцитов. Активация тромбоцитарного звена гемостаза способствует развитию каскада гемостатических изменений в первые сутки развития ОКС и требует проведения не только антитромбоцитарной, но и антикоагулянтной терапии [11].

Известно, что изофермент CYP2C9 принимает участие в метаболизме варфарина, который применяется для профилактики и лечения тромбозов. Для правильного подбора дозы варфарина и предотвращения кровотечений важно знать полиморфизм CYP2C9 у пациента [12]. Изучение влияния полиморфизма гена CYP2C9 на эффективность клопидогрела является менее изученным вопросом в сравнении с оценкой вклада полиморфизма гена CYP2C19. В отличие от детального изучения влияния полиморфизмов гена CYP2C9 на метаболизм варфарина, меньше известно о том, как эти полиморфизмы влияют на эффективность клопидогрела. Исследования показали, что носительство минорных аллелей гена CYP2C9 снижает максимальную концентрацию C_max на 47 % (p = 0,006), площадь под кривой AUC активного метаболита клопидогрела на 40 % (p = 0,043) и характеризуется на 37 % меньшим снижением агрегации тромбоцитов через 4 часа после приёма нагрузочной дозы клопидогрела 300 мг (p = 0,046), по сравнению с дикой аллелью [13]. Работы Месистской Д.Ф. и соавт. подтвердили обнаружение высокого уровня остаточной реактивности тромбоцитов (ВОРТ) у пациентов, являющихся носителями минорных генотипов CYP2C9, по сравнению с носителями дикого генотипа [14]. Исследование Harmsze A и соавт. также доказало, что носительство аллеля CYP2C9*3 характеризуется значительно более высоким уровнем ВОРТ (p < 0,05) и клинической резистентностью (ОР: 11,1, 95 % ДИ: 1,6–78,8, р = 0,016), чем у носителей аллеля дикого типа в группе из 428 пациентов, перенёсших ЧКВ на фоне терапии клопидогрелом [15].

Одновременно с этим, имеются исследования, подтверждающие значимость носительства минорного аллеля гена CYP4F2*3 в формировании ВОРТ и недостаточной эффективности клопидогрела. Исследователями было изучено влияние полиморфизма гена CYP4F2 на активность тромбоцитов у 89 пациентов с ИБС, получавших клопидогрел в составе ДАТ. Установлено, что гетерозиготы с генотипом GA по полиморфному маркеру CYP4F2 G1347A имеют более высокий уровень агрегации тромбоцитов, чем носители генотипа GG (p = 0,04) или АА (p = 0,01) [5]. Кроме того, проведённое исследование китайских коллег показало, что носительство гаплотипа GGGT, состоящего из rs2108622-rs3093100-rs3093105-rs3093135, связано с высоким риском развития ИБС (ОШ = 4,367, 95 % ДИ (доверительный интервал): 2,241 ~ 8,510; p < 0,001), в то время как носительство гаплотипа GGTA связано с низким риском развития ИБС (ОШ = 0,450, 95 % ДИ: 0,111 ~ 0,777, р < 0,001) [16]. Найденные закономерности могут быть использованы в качестве потенциальных предикторов развития ИБС [17]. Стоит отметить, что CYP4F2 является ключевым ферментом в метаболизме витамина К, который участвует в функционировании системы свёртывания крови. Известно, что носительство полиморфных аллелей гена CYP4F2 может влиять на подбор дозировки варфарина у пациентов [18]. Таким образом, изучение влияния полиморфных вариантов генов CYP2C19, CYP2C9 и CYP4F2 на клинико-лабораторные характеристики пациентов является актуальной задачей для персонализации антиагрегантной терапии у пациентов с ОКС, подвергшихся ЧКВ.

Материалы и методы исследования / Materials and methods of research

В исследовании приняли участие 59 пациентов с ОКС, которым потребовалась ЧКВ в условиях Федерального центра сердечно-сосудистой хирургии г. Астрахани и сосудистого центра Городской клинической больницы № 3 им. С.М. Кирова (г. Астрахань), в период с октября 2020 г. по май 2021 г. До поступления в стационар, пациенты находились на двойной антиагрегантной терапии: ацетилсалициловая кислота + производное тиенопиридинов (клопидогрел) — 40 (67,79 %) или ацетилсалициловая кислота + тикагрелор — 19 (32,21 %).

Для сравнения клинических групп была использована стратификация по наличию аллели CYP2C19*2. Первая группа состояла из 43 пациентов с ОКС, которые являлись носителями дикого генотипа 1/1 гена CYP2C19. Вторая группа включала 14 пациентов, которые были носителями промежуточного генотипа 1/2 гена CYP2C19. Третья группа состояла из двух пациентов с ОКС, которые были носителями полиморфного генотипа 2/2 гена CYP2C19. Результаты генотипирования были связаны с клинико-лабораторными показателями у пациентов с ОКС. Кроме того, пациенты были разделены на группы в зависимости от наличия аллелей генов CYP2C9 и CYP4F2: первая группа — носители дикого генотипа СС, вторая группа — гетерозиготы СТ, а третья группа —гомозиготы ТТ с медленным метаболизмом. Промежуточные метаболизаторы были объединены с медленными генотипами при статистической обработке результатов.

Определение полиморфных последовательностей гена CYP2C19*2 (rs4244285), CYP2C9*2 (rs1799853) и CYP4F2*3 (rs2108622) проводили на ПЦР-анализаторе BioRad CFX96 в научно-исследовательском центре ФГБОУ ВО Астраханский ГМУ Минздрава России г. Астрахани. Детекцию генотипов CYP2C19 у пациентов с ОКС осуществляли с помощью диагностического набора «ГенТест CYP2C19», производства ООО «Новые молекулярные технологии» (ООО «НОМОТЕК», г. Москва). Определение полиморфных последовательностей генов CYP2C9*2 и CYP4F2*3 осуществляли с помощью диагностического набора «ГенТест VKORC1, CYP4F2, CYP2C9», производства ООО «Новые молекулярные технологии» (ООО «НОМОТЕК», г. Москва).

Для сравнения частоты признаков в группах сравнения применяли программу статистической обработки StatTech v. 1.2.0 (разработчик — ООО «Статтех», Россия). Переменные факторы были проанализированы с помощью скорректированного 95 % ДИ. Для анализа различий между группами использовались критерии хи-квадрат, Манна-Уитни и КраскелаУоллиса. Различия считались статистически значимыми при p < 0,05. Для статистической обработки данных использовались также описательные методы статистики (среднее значение, медиана, стандартное отклонение).

Все участники исследования письменно подтвердили своё информированное согласие на участие в исследовании. В работе с больными соблюдены этические принципы, предъявляемые Хельсинской декларацией Всемирной медицинской ассоциации (1964, 2000). Исследование было одобрено локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «Астраханский ГМУ Минздрава России» (протокол № 2 от 14.04.2021).

Результаты / Results

Средний возраст пациентов в общей выборке был 62,17±12,45 года (95 % ДИ 35,23–93,03). Среди обследованных пациентов женщин было 27 (45,76 %; 95 % ДИ 0,24–0,56), мужчин — 32 (54,24 %; ДИ 0,43–0,85).

Практически все больные имели избыточный индекс массы тела. Среднее значение индекса массы тела в общей группе наблюдения (n = 59) составило 29,0±5,0 кг/м2 (95 % ДИ 19–39). Частоты генотипов CYP2C19*2 соответствовали уравнению Харди-Вайнберга: χ2 = 2,3896; р = 0,1221.

Дикий генотип *1/*1 CYP2C19 был определён у 43 (72,8 %) пациентов, гетерозиготный генотип *1/*2 — у 14 (23,7 %), а гомозиготный генотип *2/*2 — у 2 больных (3,5 %).

В таблице 1 отображены результаты анализа по изучению влияния носительства генотипов CYP2C19 (rs4244285) на клинико-лабораторные особенности пациентов с ОКС. По гендерному признаку, пациенты с ОКС были распределены в подгруппы наблюдения с учётом генетических особенностей гена CYP2C19 равномерно (p = 0,063).

Среди пациентов с ОКС, носители минорных аллелей гена CYP2C19, получающие клопидогрел, имели статистически достоверную разницу в частоте развития тромбозов и рестенозов стента. Для данной группы пациентов выявлена высокая частота клинической резистентности к клопидогрелу, что объясняется невозможностью активации пролекарства клопидогрел в его активную форму.

У пациентов с ОКС, в зависимости от диагностики носительства генотипа гена CYP2C19, были обнаружены статистически значимые различия в нескольких лабораторных показателях, таких как протромбиновое время (ПТВ) — p < 0,001 (U–критерий Манна–Уитни), международное нормализованное отношение (МНО) — p < 0,001 (U–критерий Манна–Уитни) и активированное частичное тромбопластиновое время — p < 0,001 (U–критерий Манна–Уитни) (табл. 2). Генотипы CYP4F2*3 распределились у больных с ОКС следующим образом: 32 (56,14 %) пациентов имели нормальный генотип (CC); 18 (31,5 %) являлись гетерозиготами (СТ) со сниженной активностью фермента, 7 (12,36 %) пациентов были гомозиготными по аллели T (генотип TT). Распределение аллелей и генотипов соответствовало закону Харди-Вайнберга (χ2= 3,61; p = 0,0574).

Результаты нашего анализа не показали статистически значимых различий в частоте возникновения тромбозов и рестенозов стентов у пациентов с ОКС в течение первых шести месяцев после установки стента в зависимости от наличия наследственнообусловленного полиморфизма гена CYP4F2*3 (табл. 3).

У пациентов, являющихся гетеро- и гомозиготами по минорным аллелям гена CYP4F2, были обнаружены статистически значимые различия в показателях АЧТВ и холестерина — U–критерий Манна–Уитни: p < 0,001; и p < 0,001, p = 0,023. Однако, по другим показателям, таким как глюкоза крови, триглицериды и ИМТ, статистически значимых различий обнаружено не было (табл. 4).

Проведённое исследование не показало статистически значимых различий в частоте возникновения клинической резистентности к клопидогрелу у пациентов с ОКС после ЧКВ в зависимости от наличия минорной аллели гена CYP2C9. Также не было обнаружено статистически значимых различий в частоте развития тромбоза и рестеноза стента у пациентов с ОКС в течение первых 6 месяцев после установки стента в зависимости от носительства полиморфизма гена CYP2C9 (табл. 5).

Обсуждение / Discussion

По результатам настоящего исследования у пациентов с ОКС, прошедших лечение в Федеральном центре сердечно-сосудистой хирургии и Городской клинической больнице № 3 им. С.М. Кирова в г. Астрахани, наблюдались статистически значимые различия в диагнозах при поступлении и в лабораторных показателях крови, в зависимости от генотипа CYP2C19. Научные исследования подтверждают, что у носителей генотипов «медленных метаболизаторов» CYP2C19*2 (rs4244285; генотипы *1/*2 + *2/*2) наблюдается очень медленная или практически отсутствует (rs4244285, генотип *2/*2) биотрансформация пролекарства клопидогрел в активную форму [19][20]. Результаты нашего исследования показали, что у 16 (27,2 %) жителей Астраханского региона, страдающих ОКС, было выявлено носительство полиморфных аллелей гена CYP2C19 с замедленной функцией фермента. В нашем исследовании среди 59 человек из общей выборки 67,79% пациентов с ОКС на догоспитальном этапе принимали комбинацию препаратов клопидогрел+ацетилсалициловая кислота. Данный факт может свидетельствовать о связи между недостаточной активацией клопидогрела у пациентов с замедленной функцией фермента и низкой антиагрегантной активностью препарата. Это, в свою очередь, могло спровоцировать развитие тромбоза ранее установленного стента с гемодинамически значимым стенозом у 75 % пациентов. В пользу этого говорит тот факт, что наибольшие изменения в лабораторных показателях, измеренных в первые сутки после госпитализации, наблюдались в показателях, характеризующих коагуляционный процесс гемостаза: ПТВ, МНО и АЧТВ. Очевидно, что процесс обеспечения гемодинамической стабильности в первые сутки развития ОКС или инфаркта миокарда представляет собой сложную и многогранную задачу.

Пациенты с ВОРТ, являющиеся носителями полиморфных аллелей гена CYP2C19, и принимающие клопидогрел в составе ДАТ, имеют высокий риск развития острых коронарных тромбозов и тромбозов стентов [21, 22]. Наше исследование выявило, что 75% пациентов с ОКС, которые являлись носителями полиморфных аллелей гена CYP2C19, имели тромбоз ранее установленного стента с гемодинамически значимым стенозом. Таким пациентам необходимо проводить генотипирование, и если факт носительства минорных аллелей гена CYP2C19 подтверждается, то клопидогрел следует заменить на альтернативный препарат — тикагрелор или прасугрел. В России методы фармакогенетического тестирования (ФГТ) при лечении ОКС пока широко не имплементированы. Данная ситуация может быть улучшена посредством исследований по фармакоэкономической оценке имплементации ФГТ, с последующим включением генотипирования в стандарты медицинской помощи для данной категории пациентов [20].

Модифицируемые факторы, такие как диабет, курение, ожирение и высокий ИМТ, также являются широко обсуждаемыми медицинским сообществом факторами, способными привести к тромбозу стента [23]. Научные исследования доказывают, что пациенты с ожирением, особенно с ИМТ > 30, могут иметь недостаточную дозировку тиенопиридина после стентирования, что может объясняться более высокой активацией тромбоцитов, вызванной стимуляцией рецепторов тромбина [24][25]. В настоящем исследовании нами не было выявлено статистически значимых различий в ИМТ между пациентами, обладающими диким генотипом CYP4F2, и носителями полиморфных аллелей (p = 0,324).

Ранее проведённое исследование показало, что уровни липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) оказывают влияние на клинические исходы у пациентов, перенёсших ЧКВ [8]. Такая связь была обнаружена и в других исследованиях. Например, при длительном наблюдении низкие уровни ЛПВП в сочетании с воспалительными биомаркерами влияют на клинические исходы после стентирования сонных артерий [26]. Согласно результатам исследования, скорректированное отношение рисков для первичной конечной точки составило 0,97 на каждое увеличение уровня холестерина-ЛПВП на 1 дл (95% доверительный интервал 0,95–0,99, p = 0,002), а также 2,7 [95 % ДИ 1,6–4,4, p < 0,001] для низкого уровня ЛПВП (< 40 мг/дл у мужчин и < 50 мг/дл у женщин). В результате нашего исследования было обнаружено статистически значимое повышение уровня холестерина у пациентов, являющихся носителями минорных аллелей гена CYP4F2 (p = 0,023, p < 0,05). Вероятно, этот фактор может оказывать модифицирующее воздействие на активацию тромботических процессов и способствовать развитию неблагоприятных клинических исходов у пациентов после проведения ЧКВ.

Известно, что активность изофермента CYP4F2 важна для метаболизма провоспалительных эйкозаноидов из арахидоновой кислоты и получения антитромбоцитарного и сосудорасширяющего метаболита 20-HETE, который блокирует тромбоцитарный рецептор PGH2, предотвращая связывание TxA2; предположительно, в случае носительства гетероили гомозиготного генотипов CYP4F2*3 (СТ и ТТ) у пациентов с ОКС и инфарктом миокарда уровень арахидоновой кислоты может оставаться повышенным, что в свою очередь повышает активность тромбоцитов [7]. В ходе нашего исследования было обнаружено статистически значимое различие в значениях АЧТВ у пациентов в зависимости от их генотипа CYP4F2, при чём пациенты с минорным аллелем этого гена имели существенно более низкие значения АЧТВ, что, вероятно, связано с активацией фактора Виллебранда в первые сутки развития ОКС и последующим повышением коагуляционного звена гемостаза — p < 0,001. Нами не было обнаружено статистически значимой корреляции между носительством минорного аллеля гена CYP2С9 и эффективностью клопидогрела в составе ДАТ, а также с развитием тромбозов и рестенозов стента у пациентов, перенёсших повторный ОКС в течение первых 6 месяцев после коронарного стентирования. Мы предполагаем, что это обусловлено, в первую очередь, ограниченным размером выборки пациентов, включённых в исследование, а также возможно, низкой частотой встречаемости минорных аллелей гена CYP2С9 у жителей Астраханского региона, страдающих ОКС.

Ограничения исследования / Limitations of the study

Настоящее исследование имеет ряд ограничений, которые необходимо учитывать при интерпретации результатов. Во-первых, размер выборки был небольшим (59 пациентов), что может снизить статистическую значимость и воспроизводимость результатов. Во-вторых, мы не учитывали влияние других генетических факторов, таких как полиморфизмы ABCB1 и PON1, которые также могут влиять на фармакокинетику и эффективность антиагрегантных средств. В-третьих, мы не проводили измерение уровня агрегации тромбоцитов у пациентов для оценки функционального влияния полиморфных генотипов CYP2C19, CYP2C9 и CYP4F2. Также, нами не проводилось проспективного наблюдения за пациентами для оценки долгосрочных исходов лечения. Поэтому, наши результаты требуют подтверждения в более крупных и многоцентровых исследованиях с использованием более точных методов оценки антиагрегантного эффекта.

Заключение / Conclusion

Результаты настоящего исследования показали, что полиморфизм гена CYP2C19 может быть важным фактором в развитии клинической резистентности к клопидогрелу у пациентов с ОКС. Носительство аллельных вариантов CYP4F2*3 и CYP2С9*2 не связано со статистически значимой разницей в частоте развития тромбозов и рестенозов стентов у этих пациентов. Однако, для более точной оценки этих результатов, требуется проведение дополнительных исследований на большем количестве пациентов.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

ADDITIONAL INFORMATION

Финансирование. Научное исследование осуществлено за счёт средств государственного задания Министерства здравоохранения Российской Федерации «Разработка алгоритмов персонализированного назначения антиагрегантов у пациентов с острым коронарным синдромом», годы выполнения 2021–2023 гг.

Financing. This scientific study was carried out with the support of the funds provided by the state assignment of the Ministry of Health of the Russian Federation "Development of algorithms for personalized prescription of antiplatelet agents in patients with acute coronary syndrome", for the period of 2021–2023.

Участие авторов. Кантемирова Б. И. — разработка дизайна исследования, интерпретация результатов, написание текста; Абдуллаев М. А. — статистический анализ и написание текста; Чернышева Е. Н., Китиашвили И. З. — консультационная и методическая помощь при написании рукописи статьи; Жаркова З. В. — анализ клинических данных; Романова А. Н. — оформление статьи, составление списка литературы; Коновалова Е. Р. —составление обзора литературы.

Participation of authors. Kantemirova BI — research design development, interpretation of results, text writing; Abdullaev MA — statistical analysis and text writing; Chernysheva EN, Kitiashvili IZ — consulting and methodological assistance in writing the manuscript of the article; Zharkova ZV — analysis of clinical data; Romanova AN — editing of the article text, compilation of the references list; Konovalova ER — compilation of a review of the literature.