Исследование роли мутации в гене SLC6A1 в развитии шизофрении in vitro

Введение. Шизофрения — это полиморфное полигенное психическое заболевание с не до конца изученным патогенезом [1], понимание механизмов развития которого позволит разработать новые подходы к лечению. Клиническая картина шизофрении неоднозначна: под диагнозом «шизофрения» объединён ряд отдельных синдромов, отличающихся в том числе и генетическим бэкграундом [1]. При этом заболевании выделяют позитивные, негативные и когнитивные симптомы, выраженность которых может существенно варьировать. На данный момент наиболее успешным подходом к лечению шизофрении является медикаментозная терапия антипсихотиками, которая не всегда даёт желаемый эффект в связи с клинической гетерогенностью заболевания.

Одним из подходов при разработке новых лекарств является использование для доклинических исследований клеточных моделей in vitro. Однако в случае психических заболеваний это затруднено изза ограниченного доступа к клеткам головного мозга. Животные модели недостаточно адекватны из-за межвидовых различий в строении нервной системы. В связи с этим широкое распространение получили модели на основе индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) [2]. ИПСК, полученные из фибробластов кожи пациентов, могут быть дифференцированы в нейральном направлении in vitro и затем использованы для исследования патогенеза шизофрении.

Существуют разные подходы к оценке генетической предрасположенности к развитию шизофрении. Оценка полигенного риска — наличие полиморфизмов, ассоциированных с развитием того или иного полигенного заболевания (шизофрении в том числе), — базируется на результатах полногеномного поиска ассоциаций [3]. Однако помимо полиморфизмов в генетическую архитектуру шизофрении вносят вклад вариации числа копий генов, редкие мутации и эпимутации, которые могут возникать de novo [4]. Для их выявления часто используют подход, основанный на сравнении геномных последовательностей у пробандов и их здоровых родителей (в так называемых тройках). В нашем распоряжении есть фибробласты кожи, полученные от больного шизофренией с мутацией в гене SLC6A1, ассоциированной с развитием заболевания, и его здоровых родителей. Ген SLC6A1 кодирует транспортер гамма аминомаслянной кислоты (ГАМК), отвечающий за обратный захват ГАМК из синаптической щели. Использование моделей in vitro на основе ИПСК даёт возможность изучать влияние отдельных мутаций, в частности de novo мутации в гене SLC6A1 на характеристики нервной ткани и в дальнейшем разрабатывать подходы к персонализированному лечению.

Цель. Изучить влияние мутации de novo в гене SLC6A1, кодирующем обратный транспортер ГАМК, на патогенез шизофрении.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

• Подтвердить у пробанда наличие мутации в гене SLC6A1.
• Получить и охарактеризовать ИПСК из фибробластов пробанда и родителей.
• Перепрограммировать полученные ИПСК в нейроны и провести их сравнительный анализ.
• С помощью высокоточной системы геномного редактирования Prime Editor исправить мутацию в гене SLC6A1 на стадии ИПСК, перепрограммировать ИПСК пробанда с отредактированным геномом в нейроны и вновь провести их сравнительный анализ с нейронами, полученными из фибробластов родителей.

Материалы и методы. Выделение геномной ДНК из культур клеток человека: фенол-хлороформная экстракция; амплификация гена SLC6A1 с помощью количественного метода ПЦР; секвенирование по Сенгеру (аутсорс); получение плазмид, содержащих гены Яманаки (аутсорс); наработка плазмиды: трансформация плазмиды в компетентные клетки (Escherichia coli), посев на чашки Петри на агар с ампициллином, постановка ночной культуры, выделение плазмиды набором MiniPrep (Евроген); упаковка плазмид в лентивирусы и их дальнейшее концентрирование в концентраторе центрифужном Amicon; лентивирусная трансдукция культур фибробластов родителей и пробанда; морфологический анализ ИПСК: микроскопия; анализ специфических маркеров ИПСК: покраска селективными антителами; проверка уровня экспрессии специфических маркеров ИПСК: выделение РНК и обратная транскрипция (набор ExtractRNA (Евроген), согласно инструкции производителя), синтез кДНК (набор MMLV RT (Евроген), согласно инструкции производителя), ПЦР в реальном времени (ПЦР-анализу подвергалась кДНК, полученная в ходе обратной транскрипции, для определения уровней экспрессии маркеров ИПСК в исследуемых клетках); тест на функциональную активность: способность дифференцироваться в три зародышевых листка.

Результаты. С помощью секвенирования по Сенгеру было подтверждено наличие исследуемой мутации в гене SLC6A1 в геноме пробанда, и отсутствие этой мутации в геномах родителей.

На данный момент мы находимся на этапе получения ИПСК из фибробластов кожи пробанда и родителей: получены лентивирусные трансдукты, которыми были заражены культуры фибробластов пробанда и родителей.

Заключение. Поскольку на данный момент патогенез шизофрении до конца не ясен, таргетных препаратов для её лечения нет. Однако возможность получения ИПСК из фибробластов пациентов и дифференцировка их в нейроны позволят изучать механизмы развития заболевания с учётом индивидуальных различий и эффективнее проводить скрининг препаратов для таргетной терапии и генной терапии в том числе.