Введение

Бензодиазепиновые транквилизаторы по механизму действия являются агонистами ГАМК-рецепторов [1]. Выраженность эффектов бензодиазепиновых транквилизаторов определяется взаимодействием с определёнными субъединицами данных рецепторов: альфа-1 субъединица – седативный эффект, альфа-2 субъединица – анксиолитический и в значительной степени противосудорожный эффекты, альфа-3 субъединица – противосудорожный эффект [2–4]. Применение бензодиазепиновых транквилизаторов является общепринятым подходом к лечению синдрома отмены алкоголя (СОА) [5–7]. Основным бензодиазепином, применяемым для лечения СОА в России, является отечественный препарат феназепам (бромдигидрохлорфенилбензодиазепин) [8, 9]. Бензодиазепины являются относительно безопасными лекарственными средствами (ЛС), однако им присущ ряд неблагоприятных побочных реакций (НПР), в частности развитие синдрома отмены, лекарственной зависимости, чрезмерной седации, гипотензии и падений (в особенности у пожилых), угнетение дыхания у пациентов с хронической обструктивной болезнью лёгких [5, 10]. Точный подбор индивидуальной дозы позволяет предотвратить развитие НПР при терапии бензодиазепинами. На сегодняшний день наиболее перспективным методом персонализации фармакотерапии является фармакогенетический подход, который предполагает подбор препарата и его дозы в зависимости от определяющих его фармакокинетику и фармакодинамику генетических факторов.

Согласно данным литературы, подтверждённым нашими собственными исследованиями, феназепам метаболизируется изоферментами цитохрома P-450 семейства CYP3A [11, 12]. Данные изоферменты представлены в гепатоцитах человека в виде CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7 и CYP3A43 [13], из них в метаболизме бензодиазепиновых транквилизаторов задействованы только CYP3A4 и CYP3A5 [14]. Гены, кодирующие данные изоферменты, расположены на соседних локусах 7 хромосомы [15]. Ввиду структурной схожести молекул CYP3A4 и CYP3A5 до 85 % их субстратов являются общими [16]. CYP3A5 считается высокополиморфным – описано до 25 его аллельных вариантов; функциональной аллелью считается CYP3A5*1 [16]. У европеоидов очень распространён (до 80–90 %) полиморфный вариант гена CYP3A5*3 (rs776746), характеризующийся сниженной экспрессией фермента [16]. Однако наличие хотя бы одной аллели CYP3A5*1 приводит к выраженной экспрессии CYP3A5 в печени [15]. Ген CYP3A4 низкополиморфен, поэтому активность CYP3A4 определяется преимущественно экзогенными факторами [16, 17]. Исходя из этих данных, влияние CYP3A4 на метаболизм ЛС целесообразно изучать при помощи фенотипирования изофермента: генотипирование в меньшей степени указывает на скорость метаболизма [17].

Взаимосвязь параметров фармакокинетики и фармакодинамики бензодиазепиновых транквилизаторов с полиморфизмами генов CYP3A4 и CYP3A5 изучалась лишь в незначительном количестве работ. Наиболее часто они были посвящены исследованию фармакокинетики специфичного субстрата изофермента CYP3A4 мидазолама с целью установления влияния генотипа на активность изофермента [18–21]. При этом авторами работ не рассматривались клинические эффекты мидазолама в зависимости от генотипов СYP3A4 и CYP3A5. Феназепам не зарегистрирован за пределами Российской Федерации и потому не изучался в зарубежных клинических фармакогенетических исследованиях. Необходимо проведение собственных фармакогенетических исследований для успешного применения феназепама в клинической практике. Ранее нами были изучены ассоциации носительства CYP3A5*3 с НПР при приёме феназепама [22]. Однако требуется провести анализ для другого биомаркера – полиморфизма гена CYP3A4*22, ассоциированного со снижением активности изофермента. Целью данной работы является выявление взаимосвязей между носительством полиморфизма CYP3A4*22 и параметрами безопасности приёма феназепама у пациентов с СОА.

Материалы и методы

Исследование проводилось в условиях наркологического стационара на базе Московский НПЦ наркологии с 13.10.2016 г. по 31.01.2017 г. Одобрено решением локального этического комитета ФГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России от 13.09.2016 г. Было включено 102 пациента мужского пола с диагнозом неосложнённого синдрома отмены алкоголя – СОА (F10.30 по МКБ-10), все пациенты страдали синдромом алкогольной зависимости (F10.2 по МКБ-10). Включение в исследование происходило в первые 24 ч после госпитализации. От каждого пациента было получено добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Критерии включения:

1)           возраст от 18 до 55 лет;

2)           отсутствие осложнений СОА на момент госпитализации;

3)           отсутствие коморбидного психического расстройства;

4)           отсутствие противопоказаний для приёма бензодиазепиновых транквилизаторов;

5)           отрицательный экспресс-тест на наркотики при госпитализации;

6)           согласие пациента на участие в исследовании.

Критерии невключения:

1)           несоответствие любому из критериев включения;

2)           наличие хронического соматического заболевания в стадии декомпенсации, требующего лечения в отделении интенсивной терапии.

Критерии исключения:

1)           развитие тяжёлых осложнений синдрома отмены алкоголя: делирий, судорожные припадки;

2)           выявление непереносимости бензодиазепиновых транквилизаторов;

3)           отказ больного от продолжения участия в исследовании.

Динамическое наблюдение за участниками исследования продолжалось 5 суток, согласно общепринятым клиническим рекомендациям и стандартам оказания медицинской помощи по купированию СОА. В этот период пациенты получали детоксикационную и медикаментозную терапию, в состав которой обязательно входил транквилизатор из группы бензодиазепинов. В 100 % случаев применялся бромдигидрохлорфенилбензодиазепин, или Феназепам («Фензитат», таблетки по 1 мг, производитель: ОАО «Татхимфармпрепараты», г. Казань, Россия). Помимо бромдигидрохлорфенилбензодиазепина, в ограниченном количестве случаев (n = 48) пациенты принимали Карбамазепин («Карбамазепин», таблетки по 200 мг, производитель: ЗАО «АЛСИ Фарма», г. Москва, Россия) и/или Паглюферал («Паглюферал 3» (содержит фенобарбитал, папаверин, кальция глюконат, бромизовал, кофеин-бензоат натрия), таблетки по 100 мг, производитель: ЗАО «Московская фармацевтическая фабрика», г. Москва, Россия). Назначение Карбамазепина во время купирования синдрома отмены алкоголя проводилось на усмотрение лечащего врача, суточная доза всегда составляла 300 мг. Паглюферал также назначался по усмотрению лечащего врача, в дозе 200 мг на ночь для усиления снотворного эффекта бензодиазепинов.

На 6-е сутки оценивалось наличие НПР при помощи шкалы UKUSide-EffectsRatingScale, а также проводился отбор 5 мл венозной крови. Из образцов крови была выделена нативная ДНК с использованием коммерческих наборов (производитель – ООО «Синтол»). Выделенная ДНК была заморожена при –80 С и в дальнейшем использована для генотипирования. От каждого пациента в 1-е сутки и на 6-е сутки было также получено 10 мл утренней мочи для измерения отношения уровня 6-бета-гидроксикортизола к кортизолу. Данный тест применялся с целью фенотипирования активности изофермента CYP3A4: более высокое значение метаболического отношения означало более высокую активность цитохрома. Измерение уровня кортизола и 6-бета-гидроксикортизола проводилось методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на приборе AgilentG1978BMultimodeSourcefor 6410 TripleQuadeLC/MS (AgilentTechnologies, Inc., USA).

Перечень нежелательных побочных реакций включал в себя снижение концентрации внимания, астению/вялость/повышенную утомляемость, сонливость/седацию, ухудшение памяти, депрессию, внутреннее напряжение/ беспокойство, увеличение длительности сна, уменьшение длительности сна, увеличение интенсивности сновидений, эмоциональное безразличие, нарушение аккомодации, гиперсаливация, сухость во рту, тошноту/ рвоту, диарею, запор, затруднение мочеиспускания, полиурию/полидипсию, ортостатическое головокружение, сердцебиение/тахикардию, фоточувствительность, усиление полового влечения, ослабление полового влечения, головную боль, выраженность НПР по мнению пациента и выраженность НПР по мнению врача.

Генотипирование

Количество и качество экстрагированной ДНК тестировалось на пригодность для последующих ферментативных реакций с помощью спектрофотометра для микрообъёмов NanoDrop 2000 (ThermoFisherScientific, NY, USA). В каждый раунд экстракции включали контроль на контаминацию ДНК Homosapience. Образцы ДНК хранились в элюирующем буфере при температуре -80C. Определение полиморфного варианта CYP3A4*22 (rs35599367) осуществлялось методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с применением коммерческих наборов реактивов (ООО «Синтол»), оборудование: Детектирующий амплификатор CFX96 TouchTMReal-TimePCRDetectionSystem (Bio-Rad, USA).

Статистическая обработка проводилась в программе SPSSStatistics 21.0. Применялись методы непараметрической статистики для сравнения количественных переменных между группами – критерий Манна-Уитни. Частотный анализ НПР между группами пациентов в зависимости от генотипа CYP3A4*22 проводился при помощи метода Хи-квадрат Пирсона (таблицы сопряжённости).

Результаты

Как следует из табл. 1, значимых различий между группами гомои гетерозигот не наблюдалось при сравнении возраста, особенностей течения синдрома зависимости от алкоголя, а также средней суточной дозы феназепама. Из биохимических маркеров у гетерозигот наблюдались статистически значимо более высокие уровни глюкозы и АСТ, для других биохимических показателей значимых различий не было обнаружено.

При сравнении гомозигот и гетерозигот по общему баллу шкалы UKU, её подшкалам психических нарушений и нарушений вегетативной системы, а также частотам отдельных нежелательных побочных реакций не было обнаружено статистически значимых различий (табл. 2).

При оценке значений метаболического отношения 6-бета-гидроксикортизола к кортизолу в моче в динамике не было выявлено статистически значимых различий между носителями полиморфного и «дикого» вариантов CYP3A4*22 (табл. 3).

Интересным является факт, что у носителей полиморфной аллели CYP3A4*22 отмечено увеличение активности CYP3A4 между 1и 6-ми сутками. Данные различия определены на уровне тенденции к достоверности (p = 0,051) (табл. 3). Стоит отметить, что при этом не было выявлено статистически значимых различий при сравнении групп по назначаемой медикаментозной терапии, включавшей индукторы изоферментов семейства CYP3A (табл. 4).

Обсуждение

Частота встречаемости полиморфного варианта CYP3A4*22 является низкой, составляя у европеоидов около 5 % [23, 24]. Показано, что носительство данного полиморфизма сопряжено со снижением экспрессии и активности фермента CYP3A4 в печени [20, 24]. Относительно фармакокинетики бензодиазепинов, имеются данные о снижении метаболизма мидазолама у носителей CYP3A4*22, перенёсших аллотрансплантацию почки [25].

В нашем исследовании не было обнаружено значимых различий по демографическим переменным между сравниваемыми группами, за исключением уровня глюкозы и АСТ.

Оба этих показателя были статистически значимо ниже у носителей CC генотипа. Однако данную закономерность невозможно объяснить с точки зрения изменения активности CYP3A, поэтому это является случайной находкой.

По результатам проведённого нами исследования не было получено данных, свидетельствующих о взаимосвязи полиморфного варианта гена CYP3A4*22 и показателями безопасности применения феназепама у пациентов с синдромом отмены алкоголя. Общий балл и подшкалы «Психические нарушения» и «Нарушения вегетативной нервной системы» шкалы UKU между двумя группами статистически значимо не различались. Сравниваемые группы пациентов не отличались также по частоте и выраженности отдельных нежелательных побочных реакций.

У носителей аллели Tнаблюдалось повышение активности CYP3A4 уровне тенденции к достоверности (p = 0,051). Полученные данные не могут быть объяснены одновременным приёмом паглюферала и карбамазепина, известными как индукторы изоферментов CYP3A, поскольку анализ назначаемой фармакотерапии не показал статистически значимых различий между группами в зависимости от генотипа CYP3A4*22.

Заключение

В данном исследованиии нами не было обнаружено ассоциаций полиморфизма CYP4A4*22 с параметрами безопасности терапии феназепамом у пациентов с СОА. Частота и выраженность отдельных НПР не отличалась у носителей генотипа СС и носителей Т аллели. Различия активности изофермента CYP3A4 у пациентов сравниваемых групп не достигли статистической значимости. Наиболее вероятно, что генотипирование полиморфного маркера CYP3A4*22 не является целесообразным для персонализации приёма феназепама.

Источник финансирования

Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований в рамках научного проекта №18-315-00005.

Литература / References

1.           Haefely W.E. Pharmacology of the Benzodiazepine Receptor. Eur Arch Psychiatry Neurol Sci 1989, 238(5–6):294–301.

2.           Mckernan R.M., Rosahl T.W., Reynolds D.S., Sur C., Wafford K.A., Atack J.R. et al. Sedative but not anxiolytic properties of benzodiazepines are mediated by the GABA(A) receptor alpha1 subtype. Nat Neurosci 2000, 3(6):587–592.

3.           Low K., Crestani F., Keist R., Benke D.,Brunig I., Benson J.A. et al. Molecular and neuronal substrate for the selective attenuation of anxiety. Science 2000, 290(5489):131–134.

4.           Keist R., Mandelli M., Ohler H.M, Rudolph U.W.E. Molecular Targets for the Myorelaxant Action of Diazepam. Mol Pharmacol 2001, 59(3) 442–445.

5.           Amato L., Minozzi S., Davoli M. Efficacy and safety of pharmacological interventions for the treatment of the Alcohol Withdrawal Syndrome. Cochrane Database Syst Rev 2011, 15;(6).

6.           Sachdeva A., Choudhary M., Chandra M. Alcohol withdrawal syndrome: Benzodiazepines and beyond. J Clin Diagnostic Res 2015. 9(9):VE01-VE07.

7.           АфанасьевВ.В., подред. Алкогольный абстинентный синдром. СПб: «Интермедика», 2002. с. 336.

8.           Ладыженский М.Я., Городничев А.В., Костюкова Е.Г. Бензодиазепиновые анксиолитики: востребованы ли они сегодня? Современная терапия психических расстройств 2014, 2: 20–25.

9.           Осадший Ю.Ю., Вобленко Р.А., Арчаков Д.С., Тараканова Е.А. Место бензодиазепинов в современной терапии психических расстройств (обзор доказательных исследований). Современнаятерапияпсихическихрасстройств 2016, 1:2–10.

10.         Lu X.M., Zhu J.P., Zhou X.M. The effect of benzodiazepines on insomnia in patients with chronic obstructive pulmonary disease: a metaanalysis of treatment efficacy and safety. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis 2016, 11:675–685.

11.         Maskell P.D., De Paoli G., Seetohul L., Pounder D.J. Phenazepam: The drug that came in from the cold. J Forensic Leg Med 2012, 19(3):122–125.

12.         Ivashchenko D.V., Rudik A.V., Poloznikov A.A., Nikulin S.V., Smirnov V.V., Tonevitsky A.G. et al. Which cytochrome P-450 metabolizes phenazepam? Step by step in silico, in vitro, and in vivo studies. Drug Metab Pers Ther. 2018, 33(2):65–73.

13.         Lamba J., Hebert J.M., Schuetz E.G., Klein T.E., Altman R.B. PharmGKB summary: very important pharmacogene information for CYP3A5. Pharmacogenet Genomics 2012, 22(7):555–558.

14.         Fukasawa T., Suzuki A., Otani K. Effects of genetic polymorphism of cytochrome P-450 enzymes on the pharmacokinetics of benzodiazepines. J Clin Pharm Ther 2007, 32(4):333–341.

15.         Kuehl P., Zhang J., Lin Y., Lamba J., Assem M., Schuetz J. et al. Sequence diversity in CYP3A promoters and characterization of the genetic basis of polymorphic CYP3A5 expression. Nat genet 2001, 27(4):383–391.

16.         Werk A.N., Cascorbi I. Functional gene variants of CYP3A4. Clin pharmacol ther 2014, 96(3):340–348.

17.         Zanger U.M., Schwab M. Cytochrome P-450 enzymes in drug metabolism: regulation of gene expression, enzyme activities, and impact of genetic variation. Pharmacol Ther 2013, 1(138):103–141.

18.         Miao J., Jin Y., Marunde R.L., Kim S., Quinney S., Radovich M. et al. Association of genotypes of the CYP3A cluster with midazolam disposition in vivo. Pharmacogenomics J 2009, 9(5):319–326.

19.         He P., Court M., Greenblatt D., Vonmotke L. Genotype-phenotype associations of cytochrome P-450 3A4 and 3A5 polymorphism with midazolam clearance in vivo. Clin Pharmacol Ther 2005, 77(5):373–387.

20.         de Jonge H., Elens L., de Loor H., van Schaik R.H., Kuypers D.R.J. The CYP3A4*22 C>T single nucleotide polymorphism is associated with reduced midazolam and tacrolimus clearance in stable renal allograft recipients. Pharmacogenomics J 2015, 15(2):144–152.

21.         Floyd M.D., Gervasini G., Masica A.L., Mayo G., George A.L., Bhat K. et al. Genotype-phenotype associations for common CYP3A4 and CYP3A5 variants in the basal and induced metabolism of midazolam in Europeanand African-American men and women. Pharmacogenetics 2003, 13(10):595–606.

22.         ИващенкоД.В., РыжиковаК.А., СозаеваЖ.А., ЗастрожинМ.С., ГришинаЕ.А., АгузаровА.Д. исоавт. Изучение ассоциации полиморфизма гена CYP3A5 rs776746 с безопасностью феназепама у пациентов с синдромом отмены алкоголя. Наркология 2017, 3(181): 36–47.

23.         Elens L., van Gelder T., Hesselink D.A., Haufroid V., van Schaik R. CYP3A4 variant allele for personalizing pharmacotherapy. Pharmacogenomics 2013, 14(1):47–62.

24.         Wang D., Guo Y., Wrighton S.A., Cooke G.E., Sadee W. Intronic polymorphism in CYP3A4 affects hepatic expression and response to statin drugs. Pharmacogenomics J 2011, 11(4):274–286.

25.         Okubo M., Murayama N., Shimizu M., Shimada T., Guengerich F.P., Yamazaki H. The CYP3A4 intron 6 >T polymorphism (CYP3A4*22) is associated with reduced CYP3A4 protein level and function in human liver microsomes. J Toxicol Sci 2013, 38 (3):349–354.