Двойная антитромботическая терапия (ДАТ) остается краеугольным камнем вторичной профилактики окклюзионных сосудистых событий у пациентов с острым коронарным синдромом (ОКС). Клопидогрел остается часто назначаемым компонентом ДАТ в реальной клинической практике несмотря на то что современные рекомендации отдают предпочтение другим блокаторам рецепторов P2Y12. Это связано с их доступностью и профилем безопасности (низкий риск кровотечений), но при этом доля пациентов, резистентных к ДАТ с клопидогрелом, может достигать 30–40% [7, 11, 35, 36]. Резистентность, по-видимому, обусловлена множеством факторов. Однако в условиях приверженности пациента к лечению, вариабельность ответа на клопидогрел часто детерминирована полиморфизмами генов (например, CYP2C19, ABCB1) и конкурентным межлекарственным взаимодействием на уровне системы цитохрома P450 [10, 11, 35, 36, 39].

Эффективность клопидогрела зависит как минимум от двух генетически детерминированных этапов: всасывание и метаболическая активация. Полнота всасывания в кишечнике частично определяется полиморфизмом ABCB1 (C3435T, rs1045642) — гена P-гликопротеина, функционирующего как эффлюксный насос. Известно, что носительство минорного TT-генотипа ассоциировано со сниженной экспозицией активного метаболита клопидогрела и повышенной реактивностью тромбоцитов [6, 11].

Метаболическая активация клопидогрела требует двух последовательных окислений с участием ферментов семейства цитохрома P450, где CYP2C19 играет определяющую роль в образовании активного тиолового метаболита, ингибирующего рецептор P2Y12 на тромбоцитах. Носительство аллелей CYP2C19*2 и *3 ассоциировано с уменьшением площади под фармакокинетической кривой для активного метаболита клопидогрела на 30–50%, что объясняется фенотипами промежуточного/слабого метаболизма. Такие фенотипы характерны для 20–30% пациентов европейской популяции и 50–60% — в азиатских группах, что коррелирует с высокой остаточной реактивностью тромбоцитов и ростом риска повторных сосудистых событий — от микроэмболий до крупного инсульта [3].

Аллельный вариант CYP2C19*17 (rs12248560, –806C>T) ассоциирован с повышенной экспрессией фермента, что может быть связано с более быстрой активацией клопидогрела. Метаанализ 13 исследований показал, что носители CYP2C19*17 имеют меньший риск серьезных неблагоприятных сердечно–сосудистых и цереброваскулярных событий у пациентов с коронарной болезнью сердца на клопидогреле, но повышенный риск кровотечений [4]. Влияние аллеля *17 на ответ клопидогрела не всегда однозначно связано с более низким тромботическим риском [4, 8–11] и, вероятно, модулируется взаимодействием генетических и негенетических факторов, что затрудняет прогнозирование клинических исходов, особенно у гетерозиготных носителей.

В контексте генетических факторов важно учитывать возможность модуляции эффекта клопидогрела при одновременном носительстве частых однонуклеотидных полиморфизмов разных генов, влияющих на фармакокинетику этого антиагреганта. Однако, следует отметить, что в литературе данные о сочетанном носительстве ABCB1 TT и CYP2C19*17 остаются фрагментарными: изолированно CYP2C19*17 ускоряет метаболизм клопидогрела, однако ABCB1 TT может негативно влиять на его абсорбцию, потенциально нивелируя благоприятный эффект [6].

Известно, что частота функционально значимых аллелей CYP2C19 (*2, *3, *17) и ABCB1 C3435T подвержена межэтническим вариациям. Например, доля носителей аллелей слабого метаболизма клопидогрела достигает 60% в азиатских популяциях, но не превышает 30% у европейцев [3]. Пациенты чувашской этнической группы настоящего времени мало представлены в публикациях по фармакогенетике, поэтому целью настоящего исследования стало определить полиморфизмы CYP2C19 (*2, *3, *17*) и ABCB1 C3435T, их значимые ассоциации у пациентов чувашской национальности с ССЗ, включая связь с резистентностью к клопидогрелу при ОКС.

Проведено проспективное когортное исследование в БУ «Республиканский кардиологический диспансер» Минздрава Чувашии (БУ РКД) с мая 2023 г. по декабрь 2024 г., в которое включено 216 пациентов чувашского этноса, находившихся в стационарах (самоопределение, отсутствие межэтнических браков в 2 и более поколениях) с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Все пациенты дали письменное информированное согласие на участие, забор и хранение биоматериала, исследование было одобрено локальным этическим комитетом (протоколы №5 от 23.05.2023).

Критериями включения в исследования стали: самоидентификация как этнического чуваша, возраст 18–80 лет, стационарное лечение в БУ РКД с терапией клопидогрелом (75 мг/сут) пациентов с острым коронарным синдром (ОКС с/без подъёма ST) или стенозом ≥70% коронарных артерий по данным коронароангиографии, обусловливающий необходимость реваскуляризации, терапия варфарином пациентов с ХРБС (включая оперированные дегенеративные пороки клапанов). Критериями исключения явились: иная этническая самоидентификация, возраст <18 или >80 лет, терминальная ХСН (ФВ ЛЖ <30%), ХБП 5 ст. (СКФ <15 мл/мин), декомпенсированная печеночная недостаточность (класс C по Child–Pugh), активный злокачественный процесс 3-4 гр с метастазами или гематологические опухоли, сепсис/острый инфекционный процесс, ОНМК, лизосомные болезни накопления (в т.ч. амилоидоз), дисциркуляторная энцефалопатия 3 ст. и/или психические расстройства, беременность.

Генотипирование по CYP2C19 (*2/*3/*17: rs4244285, rs4986893, rs12248560) и ABCB1 (rs1045642) проводилось методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени на амплификаторе Dtlite (НПО «ДНК–Технология», Россия) с использованием биоматериала — 4 мл ЭДТА-стабилизированной венозной крови, ДНК выделяли с помощью набора «ПРОБА-РАПИД-ГЕНЕТИКА». Для этого применяли набор «ФармакоГенетика Клопидогрел» (РЗН 2020/9678, 21.02.2020). Полученные диплотипы CYP2C19 (*2, *3, *17) трансформировали в фенотипы метаболизма клопидогрела по консенсусу Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium (CPIC) [39] и Dutch Pharmacogenetics Working Group (DPWG) [40]. Так были выделены медленные (*2/*2, *2/*3, *3/*3), промежуточные (*1/*2, *1/*3), нормальные (*1/*1) и быстрые/ультрабыстрые (*1/*17, *17/*17) метаболизаторы клопидогрела.

Для проведения оценки агрегации тромбоцитов рандомно формировали группу пациентов с ОКС (с/без подъёма ST) из общей выборки, у которых для оценки агрегации тромбоцитов забирали кровь при поступлении в БУ РКД (до нагрузочной дозы) и на 7 сутки от старта терапии антиагрегантами. Агрегацию определяли турбидиметрическим методом Борна на лазерном анализаторе АЛАТ-2 («БИОЛА», Россия) с использованием набора реагентов «МГ Технология–Стандарт». Калибровали светопропускание обогащённой тромбоцитами плазмы (0%), бедной тромбоцитами плазмы (100%), агрегацию рассчитывали по приросту оптической плотности (%) после добавления индуктора АДФ (1,25-10 мкмоль/л). Двухфазная агрегация при низких дозах АДФ (1-5 мкмоль/л) отражала нормальную чувствительность и высвобождение эндогенных агонистов, одноволновая обратимая агрегация при 10 мкмоль/л указывала на нарушения у тромбоцитов высвобождения (дефект гранулярного релиза). Значения <10% расценивались как резистентность, 11-29% — частичная резистентность, ≥30% — чувствительность к антиагрегантам.

Статистический анализ проводился с использованием программы StatTech v. 4.8.5 (ООО «Статтех», Россия). Количественные показатели оценивались на предмет соответствия нормальному распределению с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Описание количественных признаков в случае нормального распределения представлено в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение (M ± SD, в качестве меры репрезентативности для средних значений указывались границы 95% доверительного интервала (95% ДИ)), и в виде медианы с указанием 25 и 75 перцентиля (Mе [Q1; Q3]) — при распределении отличном от нормального. Сравнение двух групп по количественному показателю, распределение которого отличалось от нормального, выполнялось с помощью U–критерия Манна-Уитни, сравнение трех и более групп проводили с помощью критерия Краскела-Уоллиса. Сравнение процентных долей при анализе четырехпольных таблиц сопряжённости выполнялось с помощью точного критерия Фишера. В качестве количественной меры эффекта при сравнении относительных показателей рассчитывалось отношение шансов с 95% доверительным интервалом (ОШ; 95% ДИ). Сравнение процентных долей при анализе многопольных таблиц сопряженности выполнялось с помощью критерия хи–квадрат Пирсона. Апостериорные сравнения выполнялись с помощью критерия хи–квадрат Пирсона с поправкой Холма.

Проведено фармакогенотипирование 216 пациентов с чувашской этнической самоидентификацией, которые наблюдались в БУ РКД г. Чебоксары в период с мая 2023 г. по февраль 2024 г. Средний возраст участников исследования составил 66,5 лет (Q1–Q3: 61,0–72,0). Основные и сопутствующие заболевания представлены в табл. 1.

Фармакогенетическое тестирование пациентов-чувашей выявило наибольшую распространённость носительства полиморфизма CYP2C19*17 (–806C>T, rs12248560). Так гетерозиготный генотип CT встречался у 44,4% пациентов, гомозиготный TT — у 6,5%, что в сумме составляет 50,9% носителей T-аллеля, а минорного аллеля — 28,7%, определяя преобладание фенотипа «быстрого» метаболизма клопидогрела в чувашской популяции.

ABCB1 (3435C>T, rs1045642) отличался выраженной полиморфностью среди чувашских пациентов. Дикий генотип CC составил лишь 14,4%, у половины пациентов (50,0%) выявлены гетерозиготный вариант CT, гомозиготы TT наблюдались в 35,6%, частота минорного аллеля T среди пациентов-чувашей составила 60,6%.

Генотипирование по CYP2C19*3 (636G>A) выявило преобладание GG («дикий» ген) у 97,2%, частота минорного аллеля А составила 1,85% с выраженным отклонением от равновесия Харди-Вайнберга. CYP2C19*2 (681G>A, rs4986893) также характеризовался низкой частотой мутации: гетерозиготы GA выявлены у 18,1% пациентов, гомозигот выявлено не было, таким образом, частота минорного аллеля А среди чувашских пациентов с ССЗ составила 9,05%.

У пациентов, включенных в исследование, проанализирована частота возникновения повторных ИМ и их ассоциация с носительством изучаемых аллельных вариантов генов. При анализе случаев повторного ИМ в зависимости от генетического полиморфизма (табл. 2) статистически значимая связь были установлена только для варианта CYP2C19*17 (–806 C>T) (p=0,049 в общей выборке). В анализе развития повторных ИМ в зависимости от полиморфизма CYP2C19*17 (–806 C>T), следует отметить, что именно сопоставление CC и CT дало значимое различие. Эти результаты указывают на то, что среди обследованных пациентов-чувашей как в общей группе, так и только среди пациентов с ОКС носители гетерозиготного генотипа CT CYP2C19*17 чаще имели повторные ИМ по сравнению с носителями CC (p=0,044). Для остальных изученных маркеров — ABCB1 (3435 T>C), CYP2C19*2 и CYP2C19*3 — частота развития повторных ИМ не имела статистически значимых отличий.

Дополнительно проанализирована группа пациентов с ОКС, включавшая 142 человека, средний возраст которых составил 67 лет (Q₁–Q₃: 61,00-74,00), в выборке незначительно преобладали мужчины: 57,7% (n=82). В этой группе также был проведен анализ частоты повторных ИМ в стратификации по генетическим полиморфизмам. При оценке полиморфизма CYP2C19*17 (rs12248560, –806C>T) методом χ² Пирсона установлена статистически значимая ассоциация (p=0,037). В то же время, для остальных генетических маркеров — ABCB1 (3435C>T, p=0,329), CYP2C19*3 (636G>A, p=0,397) и CYP2C19*2 (681G>A, p=0,441) — достоверных различий в частоте повторных инфарктов не выявлено.

Распределение генотипов CYP2C19*17 как в общей выборке (χ²=1,59, p=0,21), так и в подгруппе с ОКС (χ²=1,10, p=0,29) соответствовало закону Харди-Вайнберга, подтверждая репрезентативность и генетическую однородность изученной чувашской когорты по отношению к популяции в целом. Полученные результаты демонстрируют ассоциацию CYP2C19*17 с повторными ИМ как маркера вторичных ишемических исходов, в отличие от первичного ИМ, где аналогичная связь с изучаемыми генотипами статистической значимости не достигла.

Дополнительно в группе пациентов с ОКС проведена лабораторная оценка чувствительности к антиагрегантной терапии, оценивая изменение остаточной реактивности тромбоцитов в ответ на индуктор агрегации АДФ. Агрегацию тромбоцитов оценили у всех пациентов, которые поступали с диагнозом ОКС с июня по август 2023 г. (n=30), 26,7% (n=8) из них были с повторным ИМ в анамнезе. Средний возраст этой подвыборки составил 64,4±11,6 года, где количество мужчин составило 53,3% (n=16). Все пациенты находились на ДАТ: ацетилсалициловая кислота + клопидогрел. Следует отметить, что 100% пациентам назначалась антисекреторная терапия омепразолом для профилактики желудочно-кишечных кровотечений [12].

Распределение полиморфизмов гена CYP2C19 (рис. 1А), выявило доминирование варианта CYP2C19 *17. Так, 46,7% пациентов несли хотя бы один T-аллель, что значительно превышает частоту аллелей CYP2C19*2 (гетерозиготы GA — 13,3%, GG — 86,7%) и CYP2C19*3 (полиморфные аллели GA или AA отсутствовали у 96,7%).

Рис. 1. Результаты фармакогенетического тестирования и лабораторной оценки агрегации тромбоцитов пациентов-чувашей с ОКС

Генотипы были трансформированы в фенотипы метаболизма по консенсусу CPIC и DPWG: 46,6% пациентов классифицированы как «быстрые метаболизаторы», 16,4% — «промежуточные метаболизаторы», 37% — «нормальные метаболизаторы», медленных метаболизаторов» не выявлено. Примечательно, что среди «ультрабыстрых метаболизаторов» все пациенты оказались чувствительные к антиагрегантам при лабораторной оценке функции тромбоцитов (рис. 1Б). Следует отметить, что при других фенотипических проявлениях наблюдались как чувствительные, так и резистентные к антиагрегантам. Преобладающая доля резистентных была с генотипом *1/*17, фенотипически соответствующая быстрому метаболизму.

Проведено проспективное исследование с использованием генотипирования по генам CYP2C19 и ABCB1, рекомендованных для персонализации антиагрегантной терапии ингибиторами P2Y12-рецепторов, которое включило 216 этнически однородных пациентов (чуваши по самоидентификации в двух и более поколениях) с ССЗ (см. табл. 1). Медиана возраста пациентов составила 66,5 лет [Q1–Q3 61-72], среди которых ИМ был зафиксирован у половины участников исследования (50%): впервые возникший ИМ — 36,6% больных, повторный ИМ — у 13,4%. Сразу отметим, что анализ результатов фармакогенотипирования пациентов-чувашей с ССЗ выявил некоторые особенности: довольно высокая распространённость носительства CYP2C19*17, гетерозиготный CT вариант которого был ассоциирован с повторными ИМ, а также очень высокая полиморфность ABCB1 3435C>T, которая не проявила самостоятельной статистической связи с клиническими исходами. Что касается полиморфизмов CYP2C19*2 (681G>A) и CYP2C19*3 (636G>A), ассоциированных с потерей функции фермента, их частота в чувашской популяции оказалась относительно низкой, связи этих полиморфизмов с повторными ИМ не выявлено.

Частота минорного аллеля T CYP2C19*17 среди чувашских пациентов составила 28,7%, что значительно превышает показатели азиатских популяций (0,96–13,7%) и находится в диапазоне, характерном для европеоидов (20-42%) и кавказцев (21-34%) [3, 12, 13]. Гетерозиготный генотип CT был выявлен у 44,4% обследованных (СТ — 44,4% против ТТ — 6,5%), носители которого чаще имели повторный ИМ как в общей выборке пациентов-чувашей с ССЗ (n=216, p=0,049; CC 8,5% vs. CT 19,8%), так и в подгруппе ОКС (n=142, p=0,037; CC 12,9% против CT 30,2%, p~CC–CT=0,044). Важно подчеркнуть, что распределение генотипов CYP2C19*17 как в общей выборке (χ²=1,59, p=0,21), так и в подгруппе с ОКС (χ²=1,10, p=0,29) соответствовало закону Харди-Вайнберга, подтверждая репрезентативность и генетическую однородность исследуемой чувашской когорты.

Современные исследования подтверждают значимую роль CYP2C19 в формировании ответа на антитромбоцитарную терапию ингибиторами P2Y12-рецепторов. Хорошо известно, что носительство CYP2C19*17 (rs12248560, –806C>T) связано с повышением транскрипции и активности изофермента CYP2C19, что усиливает биотрансформацию клопидогрела в активный метаболит и ингибирование P2Y12-рецепторов тромбоцитов. Множество рандомизированных клинических исследований и их метаанализы подтверждают, что усиление функции CYP2C19 ассоциировано с улучшением антиагрегантного эффекта, хотя и сопряжено с повышением геморрагического риска [4]. Однако в настоящем исследовании мы не наблюдали ни одного случая кровотечений, наоборот, была выявлена статистически значимая ассоциация носительства минорного аллеля в гетерозиготном варианте CT CYP2C19*17 с повышенной частотой повторных ИМ, а при попарном сравнении носители генотипа CT достоверно чаще имели повторные ИМ по сравнению с носителями CC (p=0,044). Этот результат на первый взгляд противоречит теоретически ожидаемому и требует более глубокого анализа и обсуждения других факторов.

Можно предположить, что определённую роль в нашем исследовании могли сыграть негенетические факторы, такие как межлекарственное взаимодействие, которое могло привести к феномену феноконверсии — расхождение между генотипически предсказанным и фактически наблюдаемым фенотипом метаболизма клопидогрела. Отметим, что в настоящем исследовании все пациенты-чуваши с ОКС, которые находились на ДАТ, получали одновременно терапию омепразолом для профилактики желудочно-кишечных кровотечений. Омепразол является ингибитором CYP2C19 и, клинически значимо может снижать активность фермента. Однако, несмотря на предупреждение FDA и рекомендации CPIC, этот ингибитор протонной помпы стандартно назначается для профилактики ЖКТ-кровотечений на фоне ДАТ из-за фармакоэкономической выгоды. Замена омепразола на пантопразол/рабепразол (слабые ингибиторы CYP2C19), вероятно, могла бы оптимизировать ДАТ без ущерба ЖКТ-профилактике.

 Известно, что омепразол снижает площадь под фармакокинетической кривой активного метаболита клопидогрела на 40-50% у быстрых метаболизаторов [4, 7-10], что и могло в нашем исследовании у пациентов с ОКС и генотипом *1/*17 (генотипически предсказанный фенотип быстрого метаболизатора) изменить фенотип в сторону замедления метаболизма. Так, при лабораторной оценке АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов наблюдалась наибольшая доля резистентных пациентов к антиагрегантам именно среди гетерозигот (см. рис. 1), тогда как среди пациентов-гомозигот TT (фенотип ультрабыстрого метаболизатора) не зафиксировано ни одного случая резистентности. Теоретически это можно объяснить тем, что исходной очень высокой активности фермента при ингибировании омепразолом сохраняется достаточный метаболизм для обеспечения антиагрегантного эффекта клопидогрела.

Дополнительным фактором, способствующим феноконверсии, можно рассмотреть системное воспаление при ОКС. Повышенный уровень провоспалительных цитокинов (например, интерлейкина-6) способен подавить экспрессию микросомальных ферментов печени [21].

ABCB1 C3435T характеризовался у чувашских пациентов высокой полиморфностью (TT 35,6%, CT 50,0%, частота минорного аллеля T — 60,6%). Полученные данные свидетельствуют о высокой встречаемости в сравнении с европейцами и азиатами, где частота распространения составляет около 50% [3, 13]. Хорошо известно, что P-гликопротеин ограничивает всасывание клопидогрела в кишечнике, выводя его обратно в просвет кишечника. Однако полиморфизм ABCB1 3435C>T, по данным литературы, ассоциирован со снижением активности транспортного белка, что теоретически должно приводить к повышению биодоступности клопидогрела. Однако метаанализы показывают, что гомозиготный генотип TT ассоциирован с достоверно повышенным риском повторных сердечно-сосудистых событий [4], но в нашем исследовании частота повторных ИМ в зависимости от полиморфизма ABCB1 не имела статистически значимых отличий.

У генотипированных нами чувашских пациентов одновременно была высокой частота носительства как CYP2C19*17, так и ABCB1 3435C>T. Фенотипически они проявляются как противоположные в аспекте реализации антиагрегантного эффекта клопидогрела. Высокая частота носительства полиморфизмов у чувашских пациентов делает ABCB1 ещё одним потенциальным факторов феноконверсии при совместном носительстве с CYP2C19*17.

Результаты исследований по ассоциациям с другими генотипами, которые могут искажать фенотип, для носителей *17 характеризуются гетерогенностью. Исследования комбинаций CYP2C19*17 и ABCB1 не выявляли аддитивного эффекта на тромбоцитарную реактивность. В когорте 101 китайского пациента CYP2C19*17 встречался редко (0,99%), не влиял на АДФ-индуцированную ингибицию. Аналогично, у 500 китайцев с ОКС ни CYP2C19*17, ни ABCB1 не коррелировали с остаточной реактивностью тромбоцитов (AДФ-агрегация >50%) [5]. Отсутствие взаимодействия (CYP2C19*17 + ABCB1) подтверждается и в азиатских популяциях, но экстраполяция на европеоидов ограничена.

В литературе также отсутствуют данные о сочетании полиморфизмов ABCB1 C3435T (TT-генотип), CYP2C19*17 с приёмом омепразола. Наше исследование косвенно демонстрирует, что при одновременном сочетании трёх факторов (носительство 2 полиморфных генов + назначение омепразола) может происходить нивелирование антиагрегантного эффекта клопидогрела [7-9, 16, 17], по-видимому, за счёт уменьшения системной экспозиции тиолового метаболита, что проявляется высокой остаточной реактивностью тромбоцитов и рисками сердечно–сосудистых событий. Пациентам с таким сочетанным генотипом лучше рекомендовать альтернативный клопидогрелу антиагрегант тикагрелор, обеспечивающий ингибирование агрегации независимо от полиморфизмов [2, 5, 6-8, 10, 19], а также использование пантопразола/рабепразола для устранения межлекарственного взаимодействия.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что у чувашских пациентов с ОКС не следует полагаться исключительно на генотип (особенно в гетерозиготном варианте) CYP2C19*17 как на маркер хорошего ответа на клопидогрел, поскольку высокая частота этого аллеля в популяции в сочетании с другими генетическими и негенетическими факторами имеет риски феноконверсии. Так, приём омепразола у носителей CYP2C19*17, особенно в гетерозиготном состоянии, требует осторожности. Предпочтительным ингибитором протонной помпы у этих пациентов может быть пантопразол, который не ингибирует CYP2C19, что позволит сохранить генетически обусловленный быстрый метаболизм. По-видимому, генотипирование по CYP2C19*17 без учёта феноконвертирующих факторов имеет ограниченную прогностическую ценность для индивидуализации антитромбоцитарной терапии у пациентов-чувашей.

Мощность настоящего исследования следует признать достаточной. Несмотря на то, что в нём приняли участие лишь 216 пациентов, результаты фармакогенетического тестирования соответствовали ожидаемым распределениям по уравнению Харди-Вайнберга, что свидетельствует о репрезентативности выборки и обоснованности экстраполяции выводов на популяционный уровень.

Ограничения исследования включают отсутствие измерения концентрации активного метаболита клопидогрела, что не позволяет окончательно подтвердить гипотезу о феноконверсии, для подтверждения требуются проспективные исследования с большей выборкой, стратифицированные по различным ингибиторам протонной помпы, с оценкой концентраций активного метаболита клопидогрела в плазме крови, а также анализом комбинированного влияния CYP2C19*17 и ABCB1 3435T на клинические исходы.