Введение

Согласно российским и европейским клиническим рекомендациям, метотрексат (МТ) применяется при стартовой терапии ревматоидного артрита (РА) и, при необходимости, комбинируется с другими базисными и/или симптоматическими противовоспалительными препаратами. Акцентируется внимание на важности регулярного контроля лабораторных показателей, позволяющего избежать нежелательных побочных реакций (НПР) МТ. Переход к биологическим или таргетным синтетическим базисным противовоспалительным препаратам (БПВП) проводится в случае его непереносимости или неэффективности [1-4].

В исследованиях частотность и характер НПР МТ различаются. По данным публикации Pincus T. не менее 72,9% больных сталкивались хотя бы с одним НПР [5]. Желудочно-кишечные реакции (тошнота, рвота, стоматит, воспалительные и эрозивные поражения слизистой) отмечались у 20-30% пациентов, что делало их наиболее частым ограничением в терапии. Гепатотоксичность с повышением уровня печёночных ферментов аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы (АЛТ, АСТ), стеатозом и фиброзом диагностировалась примерно у 10-15% пациентов. Развитие выраженного фиброза и цирроза печени встречалось значительно реже, но требовало длительного мониторинга функции печени. В этом контексте полезны рекомендации Drug-Induced Liver Injury Network (DILIN), подчёркивающие необходимость исключения других причин поражения печени и постоянного наблюдения за состоянием органа [6]. Гематологические нарушения (лейкопения, тромбоцитопения, анемия) наблюдались у 5-10% больных и требовали регулярного контроля общего анализа крови, а также приёма фолиевой кислоты для снижения риска тяжёлых НПР. Редкие, но опасные пульмонологические осложнения, включая интерстициальный пневмонит, выявлялись у 1-2% пациентов, особенно в первые месяцы приёма МТ, и требовали немедленного прекращения терапии и специализированного лечения [5, 7, 8].

В настоящее время отсутствует достоверное и чёткое понимание всех механизмов, лежащих в основе развития НПР МТ. Особое внимание уделяется однонуклеотидным полиморфизмам (single nucleotide polymorphism; SNP) белков, участвующих в метаболизме МТ, которые оказывают влияние на фармакокинетику и фармакодинамику препарата. Полиморфизмы, изученные нами ранее и влияющие на исходы терапии МТ, представлены в табл. 1, исследование связи НПР с SNP DHFR (rs70991109, rs70991108) проводится в текущем периоде.

Функционально белки, участвующие в метаболизме МТ, можно разделить на группы: транспортёры, ферменты метаболизма, регуляторы пуринового и аденозинового обменов. К транспортёрам относятся ABCB1, белок, обеспечивающий выведение МТ из клетки, и SLC19A1, ответственный за транспорт фолатов и МТ внутрь клетки. Полиморфизмы этих генов изменяют как эффективность, так и переносимость препарата. К ферментам, участвующим во внутриклеточном метаболизме МТ, принадлежат: FPGS, катализирующий полиглютамирование МТ с присоединением остатков глютамата, что активирует фармпрепарат, и GGH, выполняющий деполиглютамацию путём удаления глютаматных остатков. Их соотношение определяет как продолжительность действия, так и накопление активных форм МТ, оказывая влияние на фармакологический эффект и безопасность терапии. В метаболизме аденозина, обладающего противовоспалительным действием, ключевую роль играет ряд ферментов: 1) аденозиндеаминаза (Adenosine deaminase; ADA), удаляющий аминогруппу и преобразующий аденозин в инозин, что снижает внеклеточный уровень аденозина; 2) аденозинмонофосфат дезаминаза 1 (Adenosine monophosphate deaminase; AMPD1), трансформирующий аденозинмонофосфат (АМФ) в инозинмонофосфат (ИМФ) с высвобождением аммиака; 3) инозинтрифосфатаза (Inosine triphosphatase; ITPA), защищающий клетку от токсичности пуриновых метаболитов путём удаления фосфатной группы, препятствуя накоплению дезоксиаденозинтрифосфата; 4) аминоимидазол карбоксамид рибонуклеотид формилтрансфераза (5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide transformylase; ATIC), участвующий в синтезе пуринов de novo и являющийся ключевым ферментом синтеза аденозина. МТ оказывает опосредованное ингибирующее действие на ферменты аденозинового пути, способствуя накоплению аденозина внутри и вне клетки, реализуя противовоспалительный эффект [9]. Ключевыми ферментами метаболизма фолиевой кислоты, жизненно необходимой для синтеза ДНК, репарации, метилирования и аминокислотного обмена, являются MTHFR и DHFR. MTHFR превращает фолат в активную форму 5-метилтетрагидрофолат, участвующую в конверсии гомоцистеина в метионин, тогда как DHFR восстанавливает фолиевую кислоту до тетрагидрофолата, необходимого для функционирования MTHFR. МТ непосредственно ингибирует DHFR и косвенно снижает активность MTHFR, что нарушает синтез ДНК и клеточную пролиферацию, обеспечивая его цитотоксическое действие [10]. Полиморфизмы в генах, кодирующих вышеуказанные белки, изменяют транспорт, метаболическую трансформацию и элиминацию МТ, определяя индивидуальный риск НПР. Учёт этих особенностей позволяет персонализировать терапию, снижая риск отмены препарата из-за непереносимости. Поиски надёжных генетических маркеров ведутся в настоящее время.

Материалы и методы

Исследование получило одобрение локального этического комитета Челябинской государственной медицинской академии Министерства здравоохранения Российской Федерации (протокол №10 от 25 ноября 2012 года). В исследование включено 294 пациента с подтверждённым диагнозом РА. Работа выполнена в формате проспективной когортной модели с набором участников в течение десяти лет. Наблюдение за НПР МТ в режиме монотерапии проводилось в течение 6 месяцев.

НПР МТ оценивались на каждом визите на основании жалоб пациентов, клинического осмотра, включая состояние слизистых оболочек, и лабораторных показателей с использованием шкалы Наранжо для установления причинно-следственной связи. Гепатотоксичность диагностировалась при устойчивом повышении уровней АЛТ и АСТ (коэффициент де Ритиса 1,33±0,42) с последующей нормализацией после отмены препарата. Лейкопения устанавливалась при уровне лейкоцитов ниже 3,0×10⁹/л.

Фармакогенетический анализ направлен на изучение SNP генов, кодирующих метаболизм и транспорт МТ: ABCB1, ADA, AMPD1, ATIC, FPGS, GGH, ITPA, MTHFR, SLC19A1. Эти гены охватывают процессы транспорта МТ внутрь (1 ген) и из клетки (1 ген), полиглютамации (1 ген), деконъюгации (1 ген), а также фолатный (1 ген) и аденозиновый (4 гена) пути, включая ATIC, участвующий в синтезе пуринов de novo. Отбор SNP проводился на основе данных dbSNP, с подтверждённой ассоциацией с эффективностью и/или НПР МТ в PubMed или PharmGKB. Частота минорного аллеля каждого SNP в популяции составляла не менее 5%. В Российской Федерации ранее не проводились исследования данных SNP в контексте лечения РА МТ. Кандидатный подход позволил отобрать 12 SNP 9 генов: по одному SNP для 6 генов и по два для трёх генов. Экстракция геномной ДНК из образцов периферической венозной крови проводилась с применением коммерческого набора «Protrans DNA Box 500» (Германия). Генотипирование выполнялось методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для анализа 10 однонуклеотидных полиморфизмов — SLC19A1 rs1051266 (G80A), ABCB1 rs1128503 (C1236T) и rs2032582 (A2677C), GGH rs3758149 (C-401T), FPGS rs84451422 (A>C) и rs1544105 (C105T), ATIC rs2372536 (C347G), ADA rs244076 (T>C), AMPD1 rs17602729 (C34T), ITPA rs1127354 (C94A), — разработаны праймеры отечественного производства ООО «ТестГен». Для полиморфизмов MTHFR rs1801131 (A1298C) и rs1801133 (C677T) использовались доступные коммерческие реактивы. Детекция продуктов амплификации осуществлялась методом FLASH-анализа по конечной точке на амплификаторах QuantStudio (Applied Biosystems). Обработка и интерпретация результатов проводились с использованием программного обеспечения QuantStudio Design and Analysis Software (версия 1.5.2).

Статистический анализ для выявления сложных комплементарных связей генов, с учётом возможных их неаддитивных взаимодействий и прогнозирования риска НПР, проводили с помощью техники снижения многофакторной размерности (Multifactor Dimensionality Reduction; MDR) с получением решающих правил вида «если — то». При этом использовали алгоритм всестороннего поиска лучших моделей, а также опирались на графы энтропии, построенные на основе информационного анализа. Диагностическую эффективность полученных моделей оценивали по показателям чувствительности и специфичности, надёжность — по результатам 10-кратной перекрёстной проверки, а статистическую значимость — по критерию хи-квадрат. Расчёты и графические построения выполнены в пакете mdr (version 3.0.2).

Результаты

НПР зарегистрированы у 82 пациентов (27,89% от 294 участников). У некоторых пациентов наблюдалось сочетание нескольких НПР. Частота НПР была выше у неответчиков на терапию МТ: (n=51; 17,3%) по сравнению с ответчиками (n=31; 10,5%). Выделены три основные категории НПР: гепатотоксичность (n=50; 17,0%), реакции со стороны ЖКТ (n=29; 9,9%), включая тошноту и рвоту (n=26; 8,8%) и стоматит (n=3; 1%) пациента, а также лейкопения (n=3; 1%). Сочетание гепатотоксичности и стоматита отмечено у двух пациентов.

В ходе первого этапа фармакогенетического анализа изучали частоты SNP отобранных генов в связи с возникновением НПР на МТ. Установлено, что генотип ТТ полиморфизма rs1801133 гена MTHFR значимо чаще наблюдается у пациентов с НПР: 13,4% (11 случаев) против 6,1% (13 случаев) в группе без НПР (p=0,041, отношение шансов (ОШ) = 2,37, 95% доверительный интервал (ДИ) [1,02; 5,54]). Для различных типов НПР, таких как гепатотоксичность, нарушения со стороны ЖКТ и гематологические изменения значимых корреляций с SNP не выявлено. Анализ комбинаций аллелей показал, что их частота варьировала от 0,0099 до 0,0569 в группе без НПР и от 0,0089 до 0,0349 в группе с НПР. Эти данные не позволили выделить надёжный маркер для прогнозирования НПР терапии, поэтому исследована корреляция сочетания SNP с НПР МТ и сгенерированы модели предсказания [11].

Построение фармакогенетических моделей прогнозирования НПР требует отбора маркеров, обеспечивающих высокую точность при минимальном числе переменных. Эффективность модели определяется её способностью точно прогнозировать исходы на разных выборках из генеральной совокупности. Оптимизация достигается использованием ограниченного набора предикторов с сохранением высокой прогностической силы. Для выявления генов и их взаимодействий, влияющих на риск НПР МТ у пациентов с РА, применялся метод MDR. Процесс построения модели включал последовательные этапы отбора генетических факторов с оценкой их вклада в развитие НПР.

Автоматизированный анализ стал первым этапом поиска оптимальных фармакогенетических моделей, охватывающих от одного до трёх генов, с применением алгоритма всестороннего перебора, без учёта биохимических ролей белков, кодируемых изучаемыми полиморфизмами. В результате были выделены три лучшие модели, включающие соответственно один, два и три гена: MTHFR rs1801133; FPGS rs1544105 + GGH rs3758149; ABCB1 rs2032582 + MTHFR rs1801133 + FPGS rs4451422 (табл. 2). Анализ данных выявил, что ни одна из этих моделей не подходит для диагностического применения: они характеризовались низкой поддержкой в перекрёстной проверке (2/10, 3/10, 6/10, соответственно), что свидетельствует о недостаточной надёжности, а также имели ограниченную диагностическую эффективность, не превышающую 64%. Кроме того, простая модель, основанная на полиморфизме гена MTHFR rs1801133, не достигла статистической значимости (р <0,24). Следует отметить, что три из пяти полиморфизмов, вошедших в модели автоматического отбора, связаны с системой полиглютамации (GGH rs3758149, FPGS rs1544105 и rs4451422) и будут включены в модели, созданные на основе информационного поиска на следующем этапе анализа.

На втором этапе был проведён информационный анализ, учитывающий биохимическую функцию белков, кодируемых исследуемыми генами. Для повышения качества прогностических моделей построен граф, иллюстрирующий вклад генов в развитие НПР, основанный на информационном анализе с использованием энтропии Шеннона. Эта мера неопределённости позволила определить информационный выигрыш как разницу между вероятностными распределениями системы с учётом и без учёта отдельных генетических элементов. Граф представлен вершинами (гены) и рёбрами (их взаимодействия), при этом значения информационного выигрыша в процентах отражают вклад как отдельных генов, так и их парных взаимодействий в общую энтропию. Толщина рёбер соответствует величине выигрыша, а цвет визуализирует характер взаимодействия: оранжевый и красный — синергетическое, неаддитивное (эпистатическое), усиливающее эффект генов взаимодействие; зелёный и синий — аддитивное взаимодействие с избыточной информацией; коричневый цвет свидетельствует о слабом или независимом влиянии (рис. 1).

Рис. 1. Граф энтропии для вклада генов и их взаимодействий в риск НПР на терапию МТ

Преобладание оранжевого и красного оттенков на круговом графе свидетельствует о доминировании неаддитивных эпистатических взаимодействий генов. Избыточность проявлялась слабо и была ограничена взаимодействиями с геном MTHFR rs1801133 (зелёные рёбра). Вклад отдельных полиморфизмов в риск НПР был минимален (от 0,01% для GGH rs3758149 до 1,02% для MTHFR rs1801133), тогда как влияние взаимодействий генов было значительно выше, достигая 1,73%. Максимальные взаимодействия касались как транспортной системы (SLC19A1 rs1051266 + ABCB1 rs2032582) 1,56%, так и системы полиглютамации (GGH rs3758149 + FPGS rs1544105) 1,53%, (GGH rs3758149 + FPGS rs4451422) 1,73%, что подтверждается также короткими ветвями на дендрограмме (рис. 2).

Рис. 2. Дендрограмма сходства для вклада генов и их взаимодействий в риск НПР на терапию МТ

В прогностических моделях для НПР МТ гены системы полиглютамации проявили значимость за счёт сильных взаимодействий, что диктует необходимость их включения во все модели. Следует подчеркнуть, что при моделировании неэффективности терапии данные гены также были активны, однако соответствующая модель уступила итоговой, в которую вошли гены, отвечающие за аденозиновый и фолатный метаболические пути, а также внутриклеточный транспорт метотрексата.

Первая модель, основанная на информационном анализе, включающая три гена системы полиглютамации (FPGS rs4451422 + FPGS rs1544105 + GGH rs3758149), продемонстрировала максимальные неблагоприятные эффекты у носителей генотипа CT полиморфизма FPGS rs1544105, за исключением гетерозигот по GGH rs3758149 и FPGS rs4451422 (рис. 3). Повышенный риск наблюдался также у носителей комбинации предковых аллелей всех трёх генов (отмечено тёмно-серой ячейкой в верхнем левом углу рисунка).

Модель с высокой надёжностью (10/10), высокой значимостью (р=0,003) и хорошей чувствительностью (74,7%) обладала низкой специфичностью (44,8%), поэтому число полиморфизмов было расширено до 5 и 6.

Рис. 3. Столбчатые диаграммы числа пациентов в ячейках сочетания генотипов для трёхгенной модели полиглютамации

Столбцы слева — количество пациентов с НПР, столбцы справа — количество пациентов без НПР; темно-серые ячейки — комбинации повышенного риска, светло-серые — пониженного риска, белые — сочетание комбинаций генотипов отсутствует.

Пятигенная модель, объединяющая системы транспорта и полиглютамации (SLC19A1 rs1051266 + ABCB1 rs2032582 + FPGS rs4451422 + FPGS rs1544105 + GGH rs3758149) сохранила статистическую значимость (р <0,001) и воспроизводимость в перекрёстной проверке (10/10), продемонстрировала более высокую чувствительность (79,3%) и специфичность (63,2%), в сравнении с моделью полиглютамации (табл. 3).

Расширенная шестигенная модель, дополненная геном ATIC rs2372536, сохранила высокую степень достоверности (р <0,001) и надёжности (10/10) с качественными показателями диагностической эффективности (80,4%) и особенно высокой чувствительностью — 91,5% (табл. 2). Круговой граф отражает взаимодействие генов ATIC и FPGS (rs4451422 — 0,86% и rs1544105 — 1,05%) (рис. 1), а дендрограмма помещает аллель ATIC в число трёх пар с наибольшим взаимным синергетическим эффектом (короткие ветви красного цвета, см. рис. 2).

Таким образом, с применением метода MDR исследован вклад 12 аллельных полиморфизмов 9 генов в риск развития НПР МТ при лечении РА. Наибольшую диагностическую ценность продемонстрировали две модели, объединяющие гены системы транспорта (SLC19A1 rs1051266, ABCB1 rs2032582), полиглютамации (GGH rs3758149, FPGS rs4451422, rs1544105) и ATIC rs2372536 в шестигенной модели. Модели отличает высокая статистическая значимость (p <0,001), надёжность в перекрёстной проверке и чувствительность/специфичность 79,3 и 91,5% / 63,2 и 69,3% соответственно. Правило «если — то» («if — then») данных моделей открывает возможности прогнозирования риска НПР МТ и внедрения в клиническую практику. Предполагается, что результаты могут быть экстраполированы на терапию метотрексатом недифференцированных артритов. Шестигенная модель запатентована, готова для практического применения [12].

Обсуждение

В Российской Федерации направление, связанное с переходом к персонализированной медицине, развитию высокотехнологичных методов здравоохранения и средств здоровья-сбережения, включая рациональное применение лекарственных препаратов, признано приоритетным [13]. Эти цели касаются терапии РА как наиболее распространённого и социально значимого заболевания в ревматологии. Первоочередным является изучение предикторов терапевтического ответа на МТ как препарата первой линии лечения этого заболевания. Прогнозирование его неэффективности и НПР предопределяет выбор в пользу других БПВП. Эффективность терапии МТ частично отражают клинические маркёры, но для риска развития НПР их значимость низкая [14]. Фармакогенетические исследования предопределения непереносимости МТ обладают наибольшей прогностической ценностью, что продемонстрировано в наших ранних работах [15-17].

Осознание сложности патогенетических процессов НПР стимулировало дальнейшее исследование и генерирование программы ЭВМ для фармакогенетического тестирования в клинической практике. Для этих целей определён список ключевых генетических маркеров, влияющих на развитие НПР МТ и разработана и валидирована отечественная тест-система компанией ООО «ТестГен».

Основой практической модели явились фармакогенетические модели, учитывающие совместное влияние генов на побочные действия МТ. Модели с включением генов, кодирующие ферменты транспорта, конъюгации/деконъюгации и аденозиновый пути действия МТ, проявили наибольшую статистическую значимость. Пятигенная модель, объединяющая системы транспорта и полиглютамации (SLC19A1 rs1051266 + ABCB1 rs2032582 + FPGS rs4451422 + FPGS rs1544105 + GGH rs3758149) отражает биологические механизмы метаболизма метотрексата: ограничение поступления препарата в клетку и нарушение его преобразования в активные формы. Влияние полиморфизма аденозинового пути на развитие НПР МТ отображено в шестигенной модели (SLC19A1 rs1051266 + ABCB1 rs2032582 + FPGS rs4451422 + FPGS rs1544105 + GGH rs3758149 + ATIC rs2372536). Таким образом, НПР МТ определяются аллельными вариантами генов, кодирующих весь процесс метаболизма МТ.

Графические представления итоговых моделей, с включением 5 и 6 генов, иллюстрируют характер их взаимодействий (рис. 4). Среди генов транспортной системы наблюдается сильное взаимодействие между SLC19A1 и ABCB1. В системе полиглютамации полиморфизм GGH взаимодействует с обоими вариантами FPGS, межпарные связи внутри FPGS отсутствуют. Неаддитивное эпистатическое взаимодействие проявляют аллели ATIC (аденозиновый путь) с обоими вариантами FPGS (система глютамации) и SLC19A1 (транспортная система). Межсистемные связи генов транспорта и полиглютамации в целом слабее — примерно вдвое — по сравнению с внутрисистемными, что предполагает существование двух относительно независимых компонентов прогностической модели. Каждый из компонентов выявляет лишь часть пациентов из группы риска, а их совместное включение в модель позволяет достичь высокой диагностической эффективности.

Рис. 4. Граф энтропии для итоговых моделей взаимодействия генов в риск НПР на терапию. Метод построения графов — алгоритм Фрюхтермана-Рейнгольда

Практическая реализация работы возможна с помощью программы ЭВМ «Прогноз побочных действий метотрексата при ревматоидном артрите по результатам генотипирования пациента». Поскольку данные получены на когорте европейской популяции, высока вероятность воспроизведения результатов в большинстве регионов Российской Федерации [12].

Заключение

Информативность совокупного анализа фармакогенетических маркеров для прогноза переносимости терапии МТ у пациентов с РА превосходит предсказательную силу отдельных аллельных вариантов. Диагностическая эффективность моделей, основанных на биологических данных роли белков, кодируемых изучаемыми генами, превышает автоматические модели. Разработаны две генетические модели прогнозирования переносимости МТ, в основе которых лежат полиморфизмы, кодирующие транспорт и конъюгацию МТ. Наибольшей диагностической значимость обладает модель «SLC19A1 rs1051266 + ABCB1 rs2032582 + GGH rs3758149 + FPGS rs1544105 + FPGS rs4451422 + ATIC rs2372536» с чувствительностью 91,5% и специфичностью 69,3%. В клинической практике предлагается применять модель в виде формального правила вида «если — то» для прогнозирования развития НПР МТ.