Введение

Современная терапия шизофрении, основанная на применении антипсихотических препаратов, является эффективным методом лечения для многих пациентов. Однако по данным различных исследований, от 20 до 30% пациентов с шизофренией не отвечают на лечение или имеют неудовлетворительный ответ на лечение [1].

Причиной неэффективности лечения шизофрении может быть генетическая изменчивость, которая наряду с другими факторами определяет индивидуальные особенности ответа на лекарственную терапию шизофрении [2]. Установлено, что вклад в генетическую детерминацию ответа на лекарственную терапию вносят как распространённые, так и редкие варианты генов, ассоциированных с риском шизофрении, метаболизмом антипсихотиков, нежелательными лекарственными реакциями, а также взаимодействие между генами и внешними факторами в зависимости от этнической принадлежности [3, 4].

Фармакогенетическое тестирование помогает принять клинически значимые решения при выборе тактики лечения пациентов в тех случаях, когда антипсихотическая терапия не приводит к достижению ожидаемого клинического эффекта и присутствует риск развития хронической и в высокой степени инвалидизирующей фармакорезистентной шизофрении [5, 6]. Для содействия внедрению фармакогенетики в клиническую практику разрабатываются руководства с научно обоснованными рекомендациями по оптимизации фармакотерапии с описанием генно-лекарственных взаимодействий между генами и антипсихотиками [7]. Ответ на лекарственную терапию относится к сложным признакам человека, когда величина терапевтического эффекта при внутри и межпопуляционной полигенной изменчивости зависит от совокупности малых эффектов взаимодействия ген-ген и ген-среда на пути формирования ответа [3, 4, 8–10]. Нейробиологические механизмы фармакорезистентной к терапии шизофрении пока малопонятны. Предпринимаются попытки исследований её полигенной архитектуры, идентификации надёжно ассоциированных конкретных вариантов генов, генетической связи патофизиологии шизофрении и механизмами действия антипсихотических препаратов [9, 11]. Поэтому в настоящее время нет специфических фармакогенетических тестов для фармакорезистентной шизофрении. Фармакогенетическими маркерами с доказанным влиянием на эффективность терапии шизофрении являются полиморфные локусы генов CYP2D6 и CYP2C19 [12, 13]. Их генетические варианты влияют на функционирование цитохромов Р450, которые они детерминируют. В рекомендациях Консорциума по внедрению клинической фармакогенетики в психиатрии на этих вариантах основаны предлагаемые алгоритмы антипсихотической терапии [6]. В связи с ответом на антипсихотическую терапию шизофрении обсуждалась роль многих полиморфных вариантов генов COMT, MAOA/B, CYP1A2, ABCB1, LINC01795, DDHD2, SBNO1, KCNG2, SEMA7A, RUFY1 и других [6, 14, 15], в том числе на примере конкретных клинических случаев [6, 16]. В настоящее время многими исследователями разделяется мнение, что для каждой отдельной популяции и этнической выборки остаётся востребованным поиск тех значимых фармакогенов, полиморфные локусы которых могут выступать в качестве надёжных биомаркеров сложных эффектов взаимодействий между генами и окружающей средой в формировании общего ответа на антипсихотическую терапию.

Целью исследования явилось изучение связи ряда полиморфных локусов генов с фармакорезистентностью пациентов с шизофренией среди жителей Беларуси.

Материалы и методы

Участники и дизайн исследования. В настоящее проспективное сравнительное клиническое исследование методом направленного отбора пациентов был включён 161 человек с шизофренией (код по МКБ-10: F20), проходившие стационарное лечение в РНПЦ психического здоровья. Критериями для отбора пациентов являлись: диагноз шизофрения (код по МКБ-10: F20), возраст 18–60 лет, наличие информированного согласия на участие в исследовании, отсутствие сопутствующих соматических заболеваний в фазе обострения, отсутствие острых инфекционных заболеваний.

В основную группу фармакорезистентных пациентов вошло 104 человека в возрасте от 18 до 60 лет (38,0±1,0 лет): 62 женщины, 42 мужчины; в группу сравнения вошли 57 человек с отсутствием фармакорезистентности в возрасте от 18 до 60 лет (41,0±1,1 лет): 27 женщин, 30 мужчин. Группы были однородны по возрасту, характеристикам основного заболевания, социальному статусу. Все пациенты получали лечение психотропными лекарственными средствами в соответствии с клиническим протоколом оказания медицинской помощи пациентам с психическими и поведенческими расстройствами. К фармакорезистентным относили случаи отсутствия улучшения психопатологических симптомов, несмотря на пероральный приём адекватных доз лекарственных средств на протяжении от 6 до 8 недель, если при этом было использовано два и более антипсихотика, причём один из них был атипичным [17].

Клинические методы. На каждого пациента собирались социально-демографические данные (пол, возраст, возраст на момент начала заболевания), наследственная отягощённость психическими заболеваниями, количество госпитализаций за последние 10 лет, статус курения. Оценка состояния пациентов с расстройствами шизофренического спектра проводилась на основании шкал: общего клинического глобального впечатления – общего улучшения состояния (CGI); психометрической диагностики по шкалам для оценки негативных симптомов (SANS) и позитивных симптомов (SAPS); оценки дефекта функционирования пациентов в разных социальных сферах, оценки экстрапирамидных симптомов (ESRS-A).

Биологический материал для исследования. В качестве биологического материала для выделения геномной ДНК использовали слюну, которую собирали с использованием системы для забора слюны Oragene OG-500 (DNAgenotek, США); забор материала осуществлялся на базе клинико-диагностической лаборатории и клинических отделений стационара Республиканского научно-практического центра психического здоровья.

Фармакогенетический анализ. У пациентов, включённых в исследование, проводилось генотипирование по полиморфным локусам генов изоферментов цитохрома Р-450: CYP2D6*3, CYP2D6*4, CYP2D6*10, CYP2C9*2, CYP2C9*3, CYP2C19*2, CYP2C19*17, CYP1A2*F; локусу С3435T гена MDR1 (кодирует транспортный белок Р-гликопротеин), а также полиморфным локусам генов молекул-мишеней лекарственных средств и функционально связанных с ними белков: TaqI полиморфизм ANKK1 гена анкирин-киназы 1, полиморфизм С-1019G гена серотонинового рецептора HTR1А, полиморфизм 1438G>A гена серотонинового рецептора HTR2A, полиморфизм 5-HTTLPR гена SLC6A4 серотонинового транспортера, полиморфизм rs1414334 гена серотонинового рецептора HTR2C, полиморфизм Val158Met гена COMT – катехол-О-метилтрансферазы, полиморфизм uVNTR гена MAOA – моноаминоксидазы А, полиморфизм Val66Met гена BDNF – мозгового нейротрофического фактора, полиморфизм C957T гена дофаминового рецептора DRD2, полиморфизм UGT1A1*28 гена фермента уридиндифосфат-глюкуронозилтрансферазы UGT1A1. Геномную ДНК из слюны выделяли с помощью набора «ДНК-ВК» (Институт биоорганической химии НАН Беларуси, Беларусь). Фармакогенетическое тестирование проводили на базе Института биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси с использованием набора диагностических олигонуклеотидов для определения генетических маркеров фармакорезистентности к психотропным лекарственным средствам «OLIGO-GENFARM» (Институт биоорганической химии НАН Беларуси, Беларусь). ПЦР и ПЦР в режиме реального времени проводили на приборе CFX96 (BioRad, США). Для проведения анализа длин рестрикционных фрагментов использовали эндонуклеазы рестрикции производства NEB (Англия): AvaII (CYP2C9*2 rs1799853), KpnI (CYP2C9*3 rs1057910), SmaI (CYP2C19*2 rs4244285), KpnI (CYP2C19*17 rs12248560), BstNI (CYP2D6*4 rs3892097), ApaI (CYP1A2*1F rs762551), MboI (MDR1 rs1045642), BtsCI (HTR1A rs6295) с последующим разделением продуктов рестрикции в агарозном/акриламидном геле согласно инструкции к набору «OLIGO-GENFARM». Маркеры TaqI (rs1800497) гена ANKK1, 1438G>A (rs6311) гена HTR2A, rs1414334 гена HTR2C, Val158Met (rs4680) гена COMT, Val66Met (rs6265) гена BDNF, C957T (rs6277) гена DRD2, UGT1A1*28 (rs8175347), CYP2D6*3 (rs35742686) детектировали методом ПЦР в режиме реального времени согласно инструкции к набору «OLIGO-GENFARM». Полиморфизмы 5-HTTLPR гена SLC6A4, 30bp uVNTR гена MAOA определяли методом анализа длин амплифицированных фрагментов с помощью капиллярного электрофореза на генетическом анализаторе АВ3500 (AppliedBiosystems, США).

Статистический анализ. Для подготовки и анализа клинических данных и данных генотипирования использовалась компьютерная программа для статистической обработки данных SPSS Statistics 20.0. В качестве показателя связи между генотипами и риском развития определённого фенотипа были использованы отношение шансов (ОШ) и 95% доверительный интервал (ДИ).

Результаты

В данное исследование включён 161 пациент с шизофренией (89 женщин и 72 мужчины), из которых 104 пациента были устойчивы к фармакотерапии антипсихотиками. В контрольную группу пациентов, ответивших на лечение, входило 57 человек. Для лечения пациентов с шизофренией наиболее частым в использовании антипсихотическим препаратом был атипичный антипсихотик клозапин (42,1%), также часто применялось сочетание атипичных и типичных антипсихотиков (39,5%) (табл. 1).

Генотипирование проводилось по 19 полиморфным локусам в 15 генах. В табл. 2 для каждого полиморфного локуса исследуемых генов указаны предполагаемые аллели риска и включающие их генотипы, согласно литературным данным. В общей выборке пациентов нами был проведён анализ распределения частот аллелей для проверки соответствия закону равновесия Харди-Вайнберга. Равновесие Харди-Вайнберга соблюдалось для всех изучаемых локусов.

Для изучения связи полиморфных локусов генов с ФР проводили ассоциативный анализ в группах сравнения.

Анализ частот генотипов и аллелей обнаружил связь ФР с тремя полиморфными локусами генов CYP2D6 (rs3892097), HTR1A (rs6295), COMT (rs4680) (табл. 2). С ФР ассоциированы аллель А (CYP2D6*4) (rs3892097) гена CYP2D6 (χ2=4,124, p=0,042), аллель G гена серотонинового рецептора HTR1A (rs6295) (χ2=5,522, p=0,019, табл. 2), аллель G гена COMT (rs4680) (χ2=9,006, p=0,003) (табл. 2).

Риск развития ФР выявлен при наличии аллеля А и генотипа АG по полиморфному локусу *4 (rs3892097) гена CYP2D6 (OШ 2,159; ДИ 1,018-4,578 и OШ 2,975; ДИ 1,269-6,977 соответственно), генотипа СС (rs6295) гена HTR1A (OШ 2,703; ДИ 1,151-6,348), аллеля G (rs4680) гена COMT (OШ 2,786; ДИ 1,414-5,489). Протективность к риску развития ФР обнаружена для генотипа GG (rs3892097) гена CYP2D6 (OШ 0,463; ДИ 0,218-0,928); аллеля G (rs6295) гена HTR1A (OШ 0,367; ДИ 0,156-0,864); генотипа АА (Met/Met) (rs4680) гена COMT (OШ 0,359; ДИ 0,182-0,707).

Для дальнейшего поиска связи риска ФР с сочетанием аллелей и генотипов других полиморфных локусов генов пациентов проводили анализ сравнения частот встречаемости полиморфных локусов генов CYP2D6, HTR1A, COMT в сочетании с полиморфными локусами других генов, включённых в исследование. Значимые по отношению к признаку ФР сочетания представлены в табл. 3.

Обнаружено, что некоторые сочетания аллелей либо генотипов по полиморфным локусам генов могут значительно повышать риск ФР. Рост показателей ОШ для риска ФР обнаружен при сочетании аллеля А гена CYP2D6 с аллелем А гена CYP1A2 (OШ 2,926; ДИ 1,206-7,102); c аллелем Т гена MDR1 (OШ 3,249; ДИ 1,417-7,448), c аллелями А (гена CYP1A2) и Т (гена MDR1) (OШ 4,833; ДИ 1,753-13,328). Для аллеля G (Val) гена COMT выявлено повышение риска ФР при сочетании с аллелем L гена 5-HTTLPR (OШ 3,172; ДИ 1,500-6,709) и генотипом LL гена 5-HTTLPR (OШ 6,923; ДИ 1,900-25,227), а также с аллелем Т гена MDR1 и генотипом LL гена 5-HTTLPR (OШ 11,143; ДИ 2,415-51,414). Сочетание генотипа СС гена HTR1A с аллелем Т гена MDR1 также увеличивало риск ФР (OШ 2,564; ДИ 1,120-5,873).

Обсуждение

Целью настоящей работы было выявление фармакогенетических профилей риска развития ФР среди пациентов с шизофренией. В перечень тестируемых потенциальных фармакогенетических маркеров вошли 19 полиморфных локусов в 15 генах (CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19, CYP1A2; MDR1, ANKK1, HTR1A, HTR2A, SLC6A4, HTR2C, COMT, MAOA, BDNF, DRD2, UGT1A1), которые, согласно литературным данным, оказывают эффект как на фармакокинетику, так и на фармакодинамику антипсихотиков.

Нам не удалось обнаружить значимых различий в распределении частот аллелей и генотипов между группой фармакорезистентных пациентов и группой пациентов, ответивших на фармакотерапию антипсихотиками, по локусам: CYP2C9 (*2(rs1799853), *3(rs1057910)), CYP2C19 (*2(rs4244285), *17(rs12248560)), CYP2D6 (*3 (rs4986774), *10 (rs1065852)), ANKK1 (rs1800497), HTR2A (rs6311), HTR2C (rs1414334), MAOA(uVNTR (30bp-VNTR)), BDNF (rs6265), DRD2 (rs6277), UGT1A1 (*28 (rs3064744)).

Однако для полиморфных локусов генов CYP2D6 (rs3892097), HTR1A (rs6295), COMT (rs4680) нами обнаружена значимая связь с развитием ФР для пациентов с шизофренией. Данные полиморфные локусы ранее обсуждались в литературе в связи с поиском генетических маркеров ФР при лечении антипсихотиками в выборках различных популяций [2, 4, 5]. Наши исследования подтвердили значимость данных локусов как фармакогенетических маркеров ФР для жителей Беларуси. В табл. 4 приведены установленные в исследованиях других авторов данные о взаимосвязи отдельных генетических локусов с риском развития ФР (и нежелательных лекарственных реакций), для которых взаимосвязь с ФР подтвердилась в настоящем исследовании. Как видно, с риском ФР могут быть связаны как минорные, так и мажорные аллели. Чем чаще встречается в популяции фармакогенетический маркер, тем важнее его использовать в генетическом тестировании при выборе антипсихотической терапии.

Для полиморфного локуса rs3892097 гена CYP2D6 цитохрома Р450 наши данные согласуются с ранее полученными. Показано, что вероятность развития ФР у пациентов-носителей данного аллеля А медленного метаболизма повышена [5, 12, 24]. Встречаемость данного минорного аллеля А у лиц европейского происхождения составляет 18,55% согласно базе данных «GnomAD» (табл. 4). Нами показано, что повышение вероятности развития ФР у жителей Беларуси достоверно при сочетании аллеля А (CYP2D6*4) с распространёнными аллелями А гена CYP1A2 (rs762551) и Т гена MDR1 (rs1045642).

Частота встречаемости фармакорезистентных пациентов с генотипами A-/A- (CYP2D6/ CYP1A2), A-/T- (CYP2D6 / MDR1) или А-/A-/T- (CYP2D6 / CYP1A2 / MDR1) достигает доли в 38,8%, 46,8%, 42,2%, соответственно. А для носителей генотипов AG/AA (CYP2D6 / CYP1A2) величина показателя отношения шансов достигает максимального значения (OШ 9,143) (табл. 3), что говорит о наиболее вероятном развитии ФР у пациентов с данным сочетанием генотипов.

Частота аллеля G (Val) полиморфного локуса rs4680 гена COMT фермента катехол-О-метилтрансферазы среди фармакорезистентных пациентов с шизофренией жителей Беларуси была значимо выше (65%), чем в целом среди европейского населения (48,2%) (табл. 4), и у пациентов, ответивших на терапию антипсихотиками (40%), (табл. 2).

В литературе имеются данные, что аллель G (Val) ассоциирован с быстрым метаболизмом дофамина и риском ФР [14, 33]. Однако в других исследованиях показано, что риск ФР ассоциирован с аллелем А [34]. В нашем исследовании риск ФР связан с присутствием аллеля G полиморфного локуса rs4680 гена COMT (OШ 2,786) и увеличивался в сочетании с аллелем L (5-HTTLPR) гена транспортера серотонина SLC6A4 (OШ 6,923). Самый высокий показатель риска ФР имели носители сочетания аллелей/генотипов G-/LL/T- (COMT / SLC6A4 / MDR1) (OШ 11,143) (табл. 3).

Для полиморфного локуса rs6295 гена рецептора серотонина HTR1A ранее установлено, что снижение серотонинергической нейротрансмиссии связано с аллелем G, также обнаружившим ассоциацию с риском ряда психических расстройств [35]. Однако, согласно данным, полученным в настоящем исследовании, фактором генетического риска ФР выступает генотип СС (OШ 2,722). Среди европейского населения, согласно базе данных «GnomAD», аллели G и C встречаются с одинаковой частотой (табл. 4). В настоящем исследовании доля пациентов, носителей генотипа риска ФР СС в два раза превышает долю пациентов, ответивших на фармакотерапию антипсихотиками (30,8 и 14% соответственно), что подтверждает недавно опубликованные данные исследований [32, 36, 37], указывающих на различную значимость аллелей данного локуса в зависимости от пола и этнической принадлежности.

Выводы

Таким образом, проведённое исследование на пациентах с шизофренией, жителях Беларуси, показало значимую связь носительства полиморфных локусов генов CYP2D6 (rs3892097), HTR1A (rs6295), COMT (rs4680) с увеличением риска ФР как отдельных генетических факторов, так и в сочетании их с полиморфными локусами других исследованных генов CYP1A2 (rs762551), MDR1 (rs1045642), SLC6A4 (5-HTTLPR). Описаны фармакогенетические профили риска развития ФР при лечении антипсихотиками у лиц, страдающих шизофренией: самый высокий показатель риска ФР в нашем исследовании имели носители сочетания аллелей/генотипов G-/LL/T- генов COMT / SLC6A4 / MDR1 (OШ 11,143), а также носители генотипов AG/AA (CYP2D6 / CYP1A2) (OШ 9,143). Выявленные ассоциации носительства аллелей и генотипов полиморфных локусов генов с ответом на лечение антипсихотическими препаратами позволяют использовать их в качестве фармакогенетических маркеров при лечении антипсихотическими (типичными и атипичными) лекарственными препаратами пациентов с шизофренией, жителей Беларуси и лиц европейского происхождения. Однако полученные данные требуют подтверждения на более широкой выборке пациентов.