Введение

Эффективность и безопасность фармакотерапии зависит от особенностей всасывания, метаболизма и выведения лекарственных препаратов. Метаболизм лекарственных препаратов в большой степени обеспечивается работой группы ферментов цитохрома Р450. А наиболее известными агентами, определяющими всасывание и клиренс лекарственных препаратов, являются транспортеры растворенных веществ и Р-гликопротеин [1]. Ферменты группы цитохрома Р450 не однородны по своей функции, например, выделяют CYP3A4, CYP2C9, CYP2E1 и другие. Аналогичная ситуация и с транспортерами растворённых веществ и с Р-гликопротеином [1]. Однако ещё большее разнообразие в индивидуальные особенности фармакокинетики вносят генетические особенности организма. Изучением таких особенностей занимается фармакогенетика. Данные, полученные с использованием фармакогенетических тестов, могут помочь в улучшении качества фармакотерапии [2]. Сегодня активно изучают влияние однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) разных семейств цитохрома Р450 и белков-транспортеров лекарственных средств на безопасность и эффективность фармакотерапии, разрабатывают клинические рекомендации по внедрению таких тестов в клиническую практику [3]. Кроме этого известны расовые, этнические и географические различия в частоте встречаемости разных полиморфизмов в мире [4]. В нашем исследовании мы определили частоту CYP2C9*2 (C430T), CYP2C9*3 (А1075С), CYP2C19*2 (G681A), CYP2C19*3 (G636A), CYP2C19*17 (C806T), CYP2D6*4 (G1846A), ABCB1 (C3435T), SLCO1B1*5 (T521C) в нанайской этнической группе, что может помочь в определении приоритетности при внедрении фармакогенетического тестирования в клиническую практику в разных регионах России, а так же выявляет особенности распространённости генетических предикторов повышенной расово-этнической чувствительности к лекарственным препаратам.

Материалы и методы

Изучаемая популяция. В исследование включили 70 здоровых добровольцев (14 мужчин (20%), 56 женщин (80%)), средний возраст 43,5 года (от 22 до 70 лет) из этнической группы нанайцев, проживающих на территории Хабаровского края, Дальневосточного округа Российской Федерации. Все добровольцы были проинформированы о целях и методах исследования, дали своё добровольное информированное согласие на участие в исследовании и на забор генетического материала.

Критерии включения: принадлежность добровольцев к этнической группе нанайцев, что определялось путём самоидентификации добровольцев и их родителей [5].

Критерии не включения: в исследование не включали близких родственников (братьев, сестёр, родителей) и потомков разноэтнических браков.

Генотипирование. Для определения полиморфизмов у добровольцев забрали 5 мл венозной крови в вакуумные пробирки с реактивом ЭДТА, забор крови осуществляли в декабре 2015 года на базе амбулатории краевого ГБУ здравоохранения «Троицкая ЦРБ» МЗ Хабаровского края, с. Найхин. Образцы в замороженном состоянии доставлены в НИЦ ФГБОУ ДПО РМАНПО МЗ РФ, где проводили выделение ДНК из лейкоцитов крови с использованием набора Научно-производственной фирмы «Синтол».

Выделенную ДНК изучали на носительство следующих однонуклеотидных полиморфизмов (SNP): CYP2C9*2 (C430T), CYP2C9*3 (А1075С), CYP2C19*2 (G681A), CYP2C19*3 (G636A), CYP2C19*17 (C806T), CYP2D6*4 (G1846A), ABCB1 (C3435T), SLCO1B1*5 (T521C) методом Real-Time PCR с помощью набора Научно-производственной фирмы «Синтол» производства России, Москва, на амплификаторе RealTime CFX96 Touch (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA). Программа включала предварительную денатурацию при 95°С в течение 3 мин, затем 40 циклов: денатурация при 95°C в течение 15 секунд, отжиг при 63°C в течение 40 минут.

Клиническая интерпретация SNP

CYP2C9. Носителей генотипа *1/*1 обозначают как «extensive metabolizer». Носителей CYP2C9*2 и CYP2C9*3 аллелей в гетерозиготном состоянии (*1/*2, *1/*3) обозначали как «intermediate metabolizer», носителей сразу двух таких аллелей (*1/*2 совместно с *1/*3) и носителей этих аллелей в гомозиготном (*2/*2, *3/*3) состояниях, считают «poor metabolizers» [6].

CYP2C19. Носители генотипа *1/*1 обозначаются как «extensive metabolizer», носители двух аллелей CYP2C19*2 или CYP2C19*3 (*2/*2, *1/*2 совместно с *1/*3, *3/*3) обозначаются как «poor metabolizers», носители одной аллели CYP2C19*2 или CYP2C19*3 или при совместном носительстве одной аллели CYP2C19*17 и одной аллели CYP2C19*2 (*1/*2, *1/*3, *1/*2 совместно с *1/*17) обозначаются как «intermediate metabolizers». Носители аллелей CYP2C19*17 в гомозиготном и гетерозиготном состояниях (*1/*17, *17/*17) обозначаются как «ultrarapid metabolizer» [7].

CYP2D6. Носители генотипа (*1/*1, *1/*4) обозначаются как «extensive metabolizer». Носителей CYP2D6*4 аллели в гомозиготном состоянии (*4/*4), считают «poor metabolizers» [7].

ABCB1 (C3435T). Носители генотипа СC имеют «Normal activity» транспортера. Носительство T аллели ассоциировано с нарушением фармакокинетики лекарственных препаратов. [8].

SLCO1B1. Носители генотипа *1/*1 имеют «normal activity» транспортера. Носители SLCO1B1*5 аллели в гетерозиготном состоянии (*1/*5) — «intermediate activity», гомозиготы (*5/*5) «low activity». [9].

Клиническая характеристика генотипов представлена в табл. 1.

Популяция сравнения. В качестве группы сравнения выбрали популяцию русских, т.к. это самая крупная этническая группа в России. Набор популяции проводили по литературным данным, отдавая предпочтение исследованиям на здоровых добровольцах. Поиск литературы проводили в поисковой системе «pubmed» и на сайте e-library. При отсутствии групп здоровых добровольцев, подбирали исследования с максимальным числом пациентов. В исследование включали группы с нормальным распределением генотипов в равновесии Харди-Вайнберга.

Статистический анализ. Был проведён тест Харди-Вайнберга для подтверждения независимого распределения аллелей в изучаемых полиморфизмах, с использованием авторского калькулятора [Michael H. Court (2005-2008)].

Точный тест Фишера использовали для оценки различий частот мутантных аллелей между нанайской и русской этническими группами. Статистические данные обрабатывались в программе INSTAT. Для всех тестов Р <0,05 считали статистически значимым.

Исследование одобрено локальным этическим комитетом ФГБОУ ДПО РМАНПО МЗ РФ протокол №12 от 08 декабря 2015 г.

Результаты

У 70 здоровых добровольцев из нанайской этнической группы, определили полиморфизмы генов CYP2C19, CYP2C9, CYP2D6, ABCB1, SLCO1B1.

Для гена CYP2C9 мы обнаружили 0% частоту T аллели полиморфизма CYP2C9*2 (C430T) и рассчитать хи-квадрат по Харди-Вайнбергу было невозможно, 5,7% частоту С аллели полиморфизма CYP2C9*3 (А1075С).

Для гена CYP2C19, 24,3% частоту A аллели полиморфизма CYP2C19*2 (G681A), 8,6% частоту A аллели полиморфизма CYP2C19*3 (G636A), 2,1% частоту T аллели полиморфизма CYP2C19*17 (C806T).

Для гена CYP2D6 1,4% частоту A аллели полиморфизма CYP2D6*4 (G1846A).

Для гена ABCB1 частота Т аллели полиморфизма ABCB1 (C3435T) была 45%. Частота С аллели полиморфизма SLCO1B1*5 (T521C) была 23,6%. Частота генотипов во всех полиморфизмах соответствовала распределению по закону Харди-Вайнбергу. Резуль-таты представлены в табл. 2.

Мы сравнили частоту аллелей в нанайской этнической группе с частотой аллелей в русской этнической группе, результаты представлены в табл. 3.

Достоверных различий в частоте полиморфизмов, CYP2C9*3, ABCB1, SLCO1B1*5, между нанайцами и русскими мы не обнаружили. Однако полиморфизмы гена CYP2C19 встречались с достоверно разной частотой у русских и нанайцев, а именно полиморфизм CYP2C19*2 чаще встречался у нанайцев чем у русских — 24,3% vs 12,3% соответственно (P = 0,0002), полиморфизм CYP2C19*3 также чаще встречался у нанайцев 8,6% чем у русских 0,3% (P <0,0001), а поли-морфизм CYP2C19*17 наоборот у нанайцев встречался реже 2,1% чем у русских 27,3% (P <0,0001). Кроме того, полиморфизм CYP2D6*4 у нанайцев встречался достоверно реже, чем у русских — 1,4% vs 17,4% табл. 3.

Мы составили функциональную характеристику активности цитохромов для нанайской и русской популяции для CYP2C9 [6], CYP2C19 [7], и CYP2D6 [7] табл. 4.

Обсуждение

В России проживают множество различных коренных этнических групп. Актуальным является изучение носительства мутантных аллелей в разных популяциях, для оптимизации внедрения фармакогенетического тестирования в клиническую практику в разных регионах России.

Сегодня есть данные о наличии полиморфизмов в популяции якутов. Известно, что частота CYP2C19*2 составляет 18,1%, CYP2C19*3 составляет 3,1%, CYP2C9*2 составляет 5,1%, CYP2C9*3 составляет 6,7%, SLCO1B1*5 составляет 14%, VKOC1 (G1639A) составляет 83,2% [10-12]. У татар и башкир, частота CYP2C9*2 составляет 5,1% и 6% соответственно, CYP2C9*3 составляет 5,4% и 6,2% [13], частота CYP2D6*4 составляет 9,5% и 7,1% [14]. У ненцев частота CYP2D6*4 составляет 7,3% [15]. В этнической группе бурятов CYP2C9*2 составляет 2,3% CYP2C9*3 — 1,7%, CYP2C19*2 составляет 21%, CYP2C19*3 - 6,8% [16].

В нашем исследовании мы определили частоты некоторых полиморфизмов генов CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, ABCB1, SLCO1B1 в этнической группе нанайцев — коренного малочисленного народа Севера Российской Федерации, которые проживают на территориях, омываемых реками Амур и Уссури [17]. И сопоставили с частотой аллелей изученных полиморфизмов в русской этнической группе.

Этническую принадлежность определяли путём самоидентификации субъекта и их родителей — данный метод продемонстрировал соответствие между самоидентификацией субъекта и определением микросателитных маркёров этнической принадлежности на 99,86% [5].

CYP2C9. Полиморфизм CYP2C9*2 в данной выборке не встречался и хи-квадрат по Харди-Вайбергу рассчитать не удалось. В русской популяции этот полиморфизм встречается с частотой в 11%. Частота полиморфизма CYP2C9*3 в нанайской популяции была 5,7%, против 5,8% в русской, различия были не достоверны (P = 1,0) таблица 3. Были выявлены различия в фенотипах гена CYP2C9 — в нанайской популяции достоверно реже встречаются медленные метаболизаторы (IM+PM) в 2,7 раза, чем в русской популяции (P=0,0003, OR = 0,28, 95%CI 0,1-0,6) табл. 4. Особенности этнических различий в частоте этих полиморфизмов представлены в литературе таким образом — у европейцев 12,1%-14,7% и 6,2%-8,4%, у азиатов 0,6%-7,3% и 3,4%-11,7% соответственно [18].

На сегодняшний день есть рекомендации профессиональных сообществ Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium (CPIC) и Dutch Pharmacogenetics Working Group (DPWG) по фармакогенетическому тестированию по гену CYP2C9 для персонализации терапии антикоагулянтами, гипогликемическими и другими лекарственными препаратами [20].

CYP2C19. По полученным данным частота полиморфизмов CYP2C19*2, CYP2C19*3, CYP2C19*17 в нанайской этнической группе (24,3%, 8,6%, 2,1% соответственно) достоверно отличается от частоты в русской этнической группе. Полиморфизмы, ассоциированные с медленной активностью CYP2C19*2 и CYP2C19*3 у нанайцев встречались чаще в 1,9 (P=0,0002) и 28,6 (P<0,0001) раз соответственно, а полиморфизм CYP2C19*17, ассоциированный с ускоренным метаболизмом, встречался в 12,9 (P < 0,0001) раз реже в изучаемой популяции табл. 3. Более того в нанайской группе чаще встречаются медленные фенотипы (IM+PM) в 2,1 раз (P < 0,0001, OR = 3,7, 95% CI 2,3-6,1), а быстрый фенотип (UM) в нанайской группе встречается в 28,4 раз реже (P < 0,0001, OR=0,02, 95% CI 2,3-6,1) табл. 4. Известны этнические различия в частоте полиморфизмов, например у европейцев частота CYP2C19*2, CYP2C19*3, CYP2C19*17 составляет 13,3-16,2%, 0,1-0,6%, 20,1-42%, а у азиатов 18,5-30,3%, 0,5-6,9%, 0,96-13,7% соответственно [20]. На сегодняшний день есть рекомендации CPIC и DPWG по фармакогенетическому тестированию по гену CYP2C19 для персонализации терапии клопидогрелем, антидепрессантами, ингибиторами протоновой помпы и другими лекарственными препаратами [21].

CYP2D6. Мы изучали полиморфизм CYP2D6*4, в нанайской популяции он встречался в 12,2 раз реже, чем русской (P <0,0001) таблица 3. Однако различий фенотипов между нанайцами и русскими мы не обнаружили (P = 0,15, OR = 0,19, 95% CI 0,01-3,1) табл. 4.

Известны этнические различия в частоте полиморфизма, например, у европейцев частота CYP2D6*4, составляет 18,5%-26,3%, а у азиатов 0,42%-7,7% [22].

На сегодняшний день есть рекомендации CPIC и DPWG и Canadian Pharmacogenomics Network for Drug Safety (CPNDS) по фармакогенетическому тестированию по гену CYP2D6 для персонализации терапии тамоксифеном, наркотическими анальгетиками, антипсихотиками и другими лекарственными препаратами [23].

ABCB1 (С3435Т). В нашем исследовании частота Т аллели встречалась у нанайцев в 45% и не отличалась от частоты в русской популяции (Р=0,059), табл. 3. По литературным данным частота Т аллели у европейцев и азиатов примерно равна и составляет около 50% для обеих популяций [24]. В настоящее время не представлено клинических рекомендаций профессиональных сообществ CPIC, EMA или DPWG по использованию полиморфизма ABCB1 (C3435T) для персонализации терапии пациентам, однако есть работы о влиянии этого SNP на фармакокинетику клопидогреля [8].

SLCO1B1. Мы смотрели частоту SLCO1B1*5 у нанайцев она была 23,6% против 21,8% у русских (P = 0,69) табл. 3.

Известны этнические различия в частоте полиморфизма, например, в Европе частота SLCO1B1*5 составляет 14%—23%, а в Азии менее 10% [25]

На сегодняшний день есть рекомендации CPIC по фармакогенетическому тестированию SLCO1B1 для персонализации терапии статинами [26].

Ограничения исследования

В нашей работе мы сравнивали частоту полиморфизмов CYP2C9*2 (C430T), CYP2C9*3 (А1075С), CYP2C19*2 (G681A), CYP2C19*3 (G636A), CYP2C19*17 (C806T), CYP2D6*4 (G1846A), ABCB1 (C3435T), SLCO1B1*5 (T521C) в нанайской и русской этнических группах. По полиморфизму CYP2C9*2 (C430T), невозможно было рассчитать соответствие закону Харди-Вайнберга, поэтому мы не сравнивали частоту мутантной аллели между русскими и нанайцами для этого полиморфизма. Нанайская группа состояла из здоровых добровольцев, проживающих на территории, исторически занимаемой этой этнической группой. Группой сравнения мы выбрали русскую этническую группу, т.к. это самый многочисленный этнос в Российской Федерации, данные о частоте изучаемых полиморфизмов искали в литературе, и нашли два исследования на русских добровольцах, в первом были исследованы полиморфизмы CYP2C9*2 (C430T), CYP2C9*3 (А1075С), CYP2C19*2 (G681A), CYP2C19*3 (G636A), CYP2D6*4 (G1846A), ABCB1 (C3435T) [27], во втором CYP2C9*2 (C430T), CYP2C9*3 (А1075С), CYP2C19*2 (G681A), CYP2D6*4 (G1846A) [28], мы объединили данные о носительстве полиморфизмов у русских, однако в обеих работах не было информации о CYP2C19*17 (C806T) и SLCO1B1*5 (T521C) и мы не нашли публикации с изучением этих SNP среди русских добровольцев, поэтому взяли данные с максимальным количеством пациентов с той или иной нозологией, где не было отклонений от распределения в законе Харди-Вайнберга. По полиморфизму CYP2C19*17 (C806T) в исследование были включены русские пациенты с язвенной болезнью желудка хи-квадрат по Харди-Вайнбергу был 1,12 P = 0,29 [29], по полиморфизму SLCO1B1*5 (T521C) пациенты с гиперлипидемиями хи-квадрат по Харди-Вайнбергу был 2,8 P = 0,09 [11, 12].

Выводы

Мы обнаружили наличие полиморфизмов CYP2C9*3 (А1075С), CYP2C19*2 (G681A), CYP2C19*3 (G636A), CYP2C19*17 (C806T), CYP2D6*4 (G1846A), ABCB1 (C3435T), SLCO1B1*5 (T521C) в нанайской этнической группе. У пациентов с носительством этих полиморфизмов требуется более чуткий подход при назначении лекарственных препаратов с серьезными нежелательными реакциями. Кроме того, есть достоверные различия в носительстве некоторых полиморфизмов между нанайцами и русскими. Эти данные могут повлиять на выбор приоритетности для внедрения фармакогенетических тестов в клиническую практику в разных регионах России.

Требуется изучить распространённость и других полиморфизмов в нанайской этнической группе, а также оценить частоту полиморфизмов в других этнических группах России.

Литература

1.Almazroo O.A., Miah M.K., Venkataramanan R. Drug Metabolism in the Liver. Clin Liver Dis. 2017; 21(1): 1—20.

2.Yasmina A., Deneer V.H., Maitland-van derZee A.H. et al. Application of routine electronic health record databases for pharmacogenetic research. J Intern Med. 2014;275(6):590-604.

3.Caudle K.E., Klein T.E., Hoffman J.M. et al. Incorporation of Pharmacogenomics into Routine Clinical Practice: the Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium (CPIC) Guideline Development Process. Curr Drug Metab. 2014; 15(2): 209-217.

4.Fricke-Galindo I., Cespedes-Garro C., Rodrigues-Soares F. et al. Interethnic variation of CYP2C19 alleles, ‘predicted’ phenotypes and ‘measured’ metabolic phenotypes across world populations. Pharmacogenomics J. 2016; 16(2): 113-123.

5.Hua Tang, Tom Quertermous, Beatrix. Rodriguez, et al. Genetic Structure, Self-Identified Race/Ethnicity, and Confounding in Case-Control Association Studies. Am. J. Hum. Genet. 2005;76:268-275.

6.Caudle K.E., Rettie A.E., Whirl-Carrillo M. et al. Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium. Clinical pharmacogenetics implementation consortium guidelines for CYP2C9 and HLA-B genotypes and phenytoin dosing. Clin Pharmacol Ther. 2014; 96(5): 542-548.

7.Hicks J.K., Bishop J.R., Sangkuhl K., et al. Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium (CPIC) Guideline for CYP2D6 and CYP2C19 Genotypes and Dosing of Selective Serotonin Reuptake Inhibitors. Clin Pharmacol Ther. 2015; 98(2): 127-134.

8.Karazniewicz.-Lada M., DanielakD, Rubis B. et al. Impact of common ABCB1 polymorphism on pharmacokinetics and pharmacodynamics of clopidogrel and its metabolites. J Clin Pharm Ther. 2015;40(2):226-231.

9.Ramsey L.B., Johnson S.G., Caudle K.E. et al. The clinical pharmacogenetics implementation consortium guideline for SLCO1B1 and simvastatin-induced myopathy: 2014 update. Clin Pharmacol Ther. 2014;96(4):423-428.

10.Vasilyev F.F., Danilova D.A., Kaimonov V.S. et al. Frequency distribution of polymorphisms of CYP2C19, CYP2C9, VKORC1 and SLCO1B1 genes in the Yakut population. Res Pharm Sci. 2016; 11(3): 259-264.

11.Sychev D.A., Shuev G.N., Chertovskih J.V. et al. The frequency of SLCO1B1*5 polymorphism genotypes among Russian and Sakha (Yakutia) patients with hypercholesterolemia. Pharmgenomics Pers Med. 2016; 9:59-63.

12.Чертовских Я.В., Шуев Г.Н., Попова Н.В. и др. Полиморфизм гена SLCO1B1, ассоциированный с развитием миопатии при приеме статинов, у пациентов с гиперлипидемией русских и якутов (саха). Молекулярная медицина. 2016; 1: 54-58.

13.Korytina G., Kochetova O., Akhmadishina L. et al. Polymorphisms of Cytochrome P450 Genes in Three Ethnic Groups from Russia. Balkan Med J. 2012; 29(3): 252-260.

14.MustafinaO.E., TuktarovaI.A., KarimovD.D. et al. CYP2D6, CYP3A5, and CYP3A4 gene polymorphism in Russian, Tatar and Bashkir populations. Genetika. 2015; 51(1): 109-119

15.Duzhak T, Mitrofanov D, Ostashevskii V. et al. Genetic polymorphisms of CYP2D6, CYP1A1, GSTM1 and p53 genes in a unique Siberian population of Tundra Nentsi. Pharmacogenetics. 2000; 10(6): 531-537.

16.Makeeva O., Stepanov V., Puzyrev V. et al. Global pharmacogenetics: genetic substructure of Eurasian populations and its effect on variants of drug-metabolizing enzymes. Pharmacogenomics. 2008; 9(7): 847-868.

17.Korshunova N., Katsuyama H., Demura M. et al. Posttraumatic stress disorders in the Nanai after pollution of the Amur River: ethnocultural analysis. Environ Health Prev Med. 2013; 18(6): 485-493.

18.Cespedes-Garro C., Fricke-Galindo I., Naranjo M.E. et al. Worldwide interethnic variability and geographical distribution of CYP2C9 genotypes and phenotypes. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 2015; 11(12): 1893-1905.

19.URL: https://www.pharmgkb.org/gene/PA126

20.Fricke-Galindo I., Cespedes-Garro C., Rodrigues-Soares F. et al. Interethnic variation of CYP2C19 alleles, ‘predicted’ phenotypes and ‘measured’ metabolic phenotypes across world populations. Pharmacogenomics J. 2016; 16(2): 113-123.

21.URL: https://www.pharmgkb.org/gene/PA124

22.Lerena A., Naranjo M.E., Rodrigues-Soares F. et al. Interethnic variability of CYP2D6 alleles and of predicted and measured metabolic phenotypes across world populations. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 2014; 10(11): 1569-1583

23.URL: https://www.pharmgkb.org/gene/PA128

24.Ameyaw M.M., Regateiro F., Li T. et al. MDR1 pharmacogenetics: frequency of the C3435T mutation in exon 26 is significantly influenced by ethnicity. Pharmacogenetics. 2001; 11(3): 217-221.

25.Pasanen M.K., Neuvonen P.J., Niemi M. Global analysis of genetic variation in SLCO1B1. Pharmacogenomics. 2008 Jan; 9(1): 19-33.

26.URL: https://www.pharmgkb.org/gene/PA134865839

27.Gaikovitch E.A., Cascorbi I., Mrozikiewicz P.M. et al. Polymorphisms of drug-metabolizing enzymes CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP1A1, NAT2 and of P-glycoprotein in a Russian population. Eur J Clan Pharmacol. 2003; 59(4): 303-312.

28.Gra O., Mityaeva O., Berdichevets I. et al. Microarray-based detection of CYP1A1, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, GSTT1, GSTM1, MTHFR, MTRR, NQO1, NAT2, HLA-DQA1 and AB0 allele frequencies in native Russians. Genet Test Mol Biomarkers. 2010; 14(3): 329-342.

29.Sychev D.A., Denisenko N.P., Sizova Z.M. et al. The frequency of CYP2C19 genetic polymorphisms in Russian patients with peptic ulcers treated with proton pump inhibitors. Pharmgenomics Pers Med. 2015; 8: 111-114.