Введение 

Физиологические, психологические и гормональные различия между женщиной и мужчиной обусловливают дифференцированный подход к лечению эпилепсии в зависимости от пола пациента. Специфика терапии женской эпилепсии обусловлена, с одной стороны, структурно-функциональными особенностями гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы с циркадным и цирхоральным ритмами, влияющими на колебания концентрации противоэпилептических препаратов (ПЭП), в то время как стабильная концентрация ПЭП в крови способствует достижению эффективного контроля над приступами, с другой стороны – с развитием нежелательных лекарственных явлений (НЛЯ), влияющих на репродуктивную функцию [12]. Развитие НЛЯ связано, как с фармакокинетикой (высвобождением лекарства, абсорбцией, распределением, метаболизмом, экскрецией), так и с фармакогенетикой (генетически детерминированным снижением активности фермента, участвующего в метаболизме ПЭП) [1, 3, 13]. Вклад генетических факторов в развитие НЛЯ является дискутабельным, однако подбор эффективной дозы ПЭП и минимизация НЛЯ должны осуществляться с учётом индивидуальных особенностей фармакогенетики ПЭП [2]. Это объясняет актуальность изучаемой нами проблемы персонализированного подхода к терапии эпилепсии у женщин детородного возраста в условиях современной демографической ситуации в России.

Цель исследования 

Целью исследования было изучение влияния однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) гена CYP2C9 изофермента 2C9 цитохрома P450 печени на концентрацию вальпроевой кислоты в крови женщин детородного возраста, страдающих эпилепсией, и принимающих в качестве основного ПЭП вальпроаты.

Материалы и методы 

В исследование включены 352 пациентки, фертильного возраста, страдающие эпилепсией. Работа выполнена в рамках комплексных исследований по теме «Эпидемиологические, генетические и нейрофизиологические аспекты заболеваний нервной системы (центральной, периферической и вегетативной) и превентивная медицина» (номер госрегистрации 0120.0807480) на базе неврологического центра эпилептологии, нейрогенетики и исследования мозга Университетской клиники (г. Красноярск). Исследование одобрено на заседании Локального этического комитета ГБОУ ВПО «Красноярский государственный университет им. профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава РФ. Включение пациенток в исследование осуществлялось после подписания добровольного информированного согласия.

Методы исследования: ретроспективный анализ жалоб и анамнеза (по амбулаторным картам); анализ суточных доз ПЭП; лабораторные методы исследования, включая биохимический скрининг, исследование концентрации противоэпилептических препаратов в плазме крови, молекулярно-генетическое исследование полиморфных аллельных CYP2C9. Исследование концентрации вальпроевой кислоты в плазме крови проводилось методом хемилюминесцентного иммуноанализа (в мкг/мл) в одной точке (через 2 часа после приёма ПЭП), так и (по показаниям) в трёх точках: до приёма ПЭП, через 2 часа после приёма ПЭП и на истощении дозы ПЭП. Анализ проводился на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории ГБОУ ВПО «Красноярский государственный университет им. профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава РФ (г. Красноярск), лаборатории «Инвитро» (г. Красноярск), лаборатории ФГБУ «НИИ медицинских проблем Севера» СО РАН (г. Красноярск). Референсный коридор уровня вальпроевой кислоты в крови составил 50-100 мкг/мл. Субтоксический уровень вальпроевой кислоты определён в диапазоне от 90 до 100 мкг/мл, токсический уровень – свыше 100 мкг/мл.

Молекулярно-генетическое исследование проводилось методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием образцов олигонуклеотидных меченных флюорофором агентов (технология TaqMan, «Rotor-Gene 6000», Corbet Life Science, Австралия). Проведено исследование полиморфных аллельных вариантов гена CYP2C9 на хромосоме 10q24.1 - 24.3, кодирующего изофермент 2С9 цитохрома Р450 печени, включая: аллельный вариант «дикого» типа CYP2C9*1, не имеющий мутации в виде однонуклеотидной замены; полиморфный аллельный вариант CYP2C9*2 (R144C, c.430 С > Т – однонуклеотидная замена цитозина на тимин в положении 430); полиморфный аллельный вариант CYP2C9*3 (I359L, c.1075 А > С – однонуклеотидная замена аденина на цитозин в положении 1075). Для молекулярно-генетического исследования использовали образцы крови из кубитальной вены, собранные в вакутейнер с этилендиаминтетрауксусной кислотой (EDTA – ethylenediaminetetraacetic acid, англ.) в объёме 5 мл. Молекулярно-генетическое исследование проводилось на базе Межкафедральной лаборатории медицинской генетики и Центральной научно-исследовательской лаборатории ГБОУ ВПО «Красноярский государственный университет им. профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава РФ (г. Красноярск), лаборатории «Инвитро» (г. Красноярск). Всего выделено ДНК у 148 из 199 (74,4%) пациенток, принимающих препараты вальпроевой кислоты, и подписавших добровольное информированное согласие. Генотипы были определены в зависимости от наличия или отсутствие продукта амплификации с использованием двух ДНК-зондов (в 2 направлениях полиморфизма CYP2C9), каждый из которых содержал флуоресцентный знак и супрессоры флуоресценции. Наличие того или иного изучаемого ОНП (CYP2C9*2 или CYP2C9*3), определялось наличием флуоресценции в амплифицированной смеси. Отрицательный контроль был включён в каждом эксперименте, где матрица ДНК для ПЦР была заменена на дистиллированную воду.

Описательная статистика для качественных учётных признаков представлена в виде абсолютных значений, процентных долей и ошибок долей. Данные для вариационных рядов с непараметрическим распределением описаны в виде медианы и 25 и 75 перцентилей – Ме [P25; P75]. Для выбора критерия оценки значимости различий проверяли соответствие формы распределения нормальному, используя критерий Шапиро-Уилкса. Общее межгрупповое различие оценивалось при помощи Н-критерия Крускала-Уоллиса. В случае обнаружения различия нескольких выборок проводили множественное сравнение с использованием непараметрических вариантов критериев: Даннета (для сравнения всех выборок с контрольной выборкой – без мутации гена) и Ньюмена-Кейлса (для попарного сравнения выборок). Для проверки гипотезы о равенстве долей использовали критерий χ2 с процедурой попарного сравнения (Мараскуило). Для всех критериев критическое значение уровня значимости принималось p≤0,05. Статистическая обработка результатов проводилась с помощью пакетов прикладных программ STATISTICA v. 7.0, SPSS Statistics 17.0, XLSTAT.

Результаты и их обсуждение 

Молекулярно-генетическое исследование полиморфных аллельных вариантов гена CYP2C9 изофермента 2С9 цитохрома Р450 печени проведено у 148/199 (74,4±3,1%) пациенток, принимающих препараты вальпроевой кислоты. Возраст больных варьировал от 16 до 47 лет; медиана возраста (Ме [Р25:Р75]) составила 27 [23:33] лет. В результате статистической обработки полученных данных, нами показано, что распространённый гомозиготный генотип CYP2C9*1/*1 диагностирован у 100/148 (67,6%) пациенток. Гетерозиготный генотип CYP2C9*1/*2 встречался у 18/148 (12,2±2,7%) женщин, а CYP2C9*1/*3 – у 28/148 (18,9±3,2%). Компаунд-гетерозигота (генотип CYP2C9*2/*3) встречалась реже – у 2/148 (1,4±0,9%) женщин (табл. 1).

Полученные нами результаты молекулярно-генетического исследования носительства полиморфных аллельных вариантов гена CYP2C9 цитохрома Р450 у женщин фертильного возраста, жительниц Красноярского края, по частоте встречаемости генотипа CYP2C9*2 коррелируют с данными, полученными в странах Европы и европейской части России –  12,2%, а по частоте встречаемости генотипа CYP2C9*3 (18,9%) – превышают частоту встречаемости в странах Европы (8-10%) и в европейской части России, но сопоставимы с частотой встречаемости в Турции (17,2%) [3] и Италии (14,5%) [4]. Частота носительства компаунд-гетерозигот CYP2C9*2/*3 (1,4%) сопоставима с частотой встречаемости в Турции (1,1%) [3] и Италии (2,0%) [4]. Высокую частоту встречаемости полиморфного аллельного варианта CYP2C9*3 в исследуемой нами выборке можно объяснить меньшим влиянием дрейфа генов европейской популяции и большим влиянием дрейфа генов азиатской популяции на население центральной и восточной Сибири. Так, в проведённых ранее исследованиях показано, что у азиатов полиморфизм CYP2C9*3 встречается чаще, чем полиморфизм CYP2C9*2 [5-8].

Частота встречаемости аллелей гена в локусе CYP2C9 изофермента 2С9 цитохрома Р450 печени у наблюдаемых пациенток представлена в табл. 2.

Суточная доза вальпроатов у пациенток-носительниц с различными генотипами CYP2C9 была сопоставима и соответствовала рекомендуемым суточным дозам у взрослых (20-30 мг/кг/сут). Токсическая и субтоксическая концентрации вальпроевой кислоты в крови у наблюдаемых женщин детородного возраста, страдающих эпилепсией, с большей частотой случаев выявлена у носительниц генотипа CYP2C9*1/*2 (38,5%, р<0,01) и у компаунд-гетерозигот (100%) (р<0,01) и в меньшей мере – у гетерозиготных носительниц CYP2C9*1/*3 (33,3%). Что так же статистически значимо превышало частоту встречаемости случаев токсической концентрации вальпроевой кислоты в крови на фоне приёма средне-терапевтических доз вальпроатов по сравнению с носительницами распространённого аллельного варианта CYP2C9*1/*1 (12,5%) (табл. 3).

Примечания:

1 – наличие статистически значимых различий между группами по Н-критерию Крускала-Уоллиса при p<0,05;

2 – наличие статистически значимых различий с CYP2C9*1/*1 по критерию Даннета при p<0,05 (различий долей по критерию χ2);

3 – наличие статистически значимых различий между CYP2C9*1/*2 и CYP2C9*1/*3 по критерию Ньюмена-Кейлса при p<0,05 (различий долей по критерию χ2);

4 – наличие статистически значимых различий между CYP2C9*1/*2 и CYP2C9*2/*3 по критерию Ньюмена-Кейлса при p<0,05 (различий долей по критерию χ2);

5 – наличие статистически значимых различий между CYP2C9*1/*3 и CYP2C9*2/*3 по критерию Ньюмена-Кейлса при p<0,05 (различие долей по критерию χ2).

Суточная доза вальпроатов у пациенток с высоким уровнем ВК в крови при первичном обращении в НЦ УК была нами снижена с учётом фармакогенетического профиля на 20,8% при генотипе CYP2C9*1/*1, на 16,7% – при генотипе CYP2C9*1/*2, на 10,0% – при генотипе CYP2C9*1/*3, на 15,5% – при генотипе CYP2C9*2/*3 до достижения средне-терапевтической концентрации ВК в крови. Тенденция к кумуляции ВК сохранялась у гетерозиготных носительниц полиморфного аллельного варианта CYP2C9*1/*2 и после снижения дозировки ПЭП в среднем на 16,7% от исходного (табл. 3 и 4). Две пациентки-носительницы CYP2C9*2/*3 – после коррекции дозы вальпроатов (снижение дозы в среднем на 15,5% от исходного) на повторный осмотр к неврологу-эпилептологу на момент обработки базы данных не явились. Полученные результаты согласуются с доступными литературными данными [9-12, 14] о более высоком риске кумуляции ВК и других ксенобиотиков, метаболизирующихся в печени у носителей полиморфного аллельного варианта гена CYP2C9*1/*2. 

Таким образом, частота кумуляции ВК в крови у носительниц компаунд-гетерозигот была в 8 раз выше, при носительстве CYP2C9*1/*2 в 2,6 раза выше и у носительниц CYP2C9*1/*3 в 3 раза выше, чем при гомозиготном носительстве распространённого аллельного варианта CYP2C9*1/*1. В целом, больший риск замедления метаболизма вальпроевой кислоты в печени отмечен у носительниц генотипа CYP2C9*1/*2, несмотря на меньшую частоту его встречаемости в исследуемой выборке по сравнению с CYP2C9*1/*3 (13,5% против 20,3% соответственно, р<0,01). Согласно анализу оценки риска, риск кумуляции ВК в крови был в 1,82, 2,1 и 5,46 раза выше при генотипах CYP2C9*1/*3, CYP2C9*1/*2 и CYP2C9*2/*3 соответственно, чем при генотипе CYP2C9*1/*1.

Выводы 

Снижение активности изофермента 2С9 цитохрома Р450 печени у носительниц генотипов CYP2C9*1/*2 и CYP2C9*1/*3 требует индивидуального подбора дозы препаратов вальпроевой кислоты у женщин детородного возраста, принимающих препараты вальпроевой кислоты, поскольку повышается риск кумуляции ВК в крови, что является предиктором развития серьёзных НЛЯ, включая повышение тератогенного потенциала препаратов ВК [15-17]. Таким образом, персонализированный подход к подбору разовой и суточной дозы препаратов ВК с учётом фармакогенетического профиля пациентки является научно и клинически обоснованным и может быть рекомендован к внедрению в повседневную клиническую практику эпилептолога (невролога, психиатра). 

Литература