Введение

Туберкулёз (ТБ) занимает 2-ое место по причинам смертности среди инфекционных заболеваний [1]. Стандартная терапия ТБ включает следующие препараты: изониазид, рифампицин, этамбутол и пиразинамид. При лечении новых случаев заболевания ТБ лёгких ВОЗ рекомендует назначать 6-месячный режим лечения, который состоит из 2-месячного курса всех 4 препаратов первого ряда и 4-месячного курса изониазида и рифампицина [2]. Таким образом, изониазид является одним из наиболее распространённых и эффективных противотуберкулёзных препаратов. Однако он обладает выраженными побочными эффектами, одним из которых является изониазид-индуцированное поражение печени (ИИПП) [3].

В метаболизме данного препарата в организме человека принимает участие N-ацетилрансфераза 2 типа (NАТ2). ИИПП считается идиосинкразированной, в основе которой лежит воздействие высокоактивных метаболитов изониазида на печень пациента. К таким метаболитам относят гидразин и ацетилгидразин [4]. В зависимости от генетически детерминированной скорости ацетилирования NAT2 выделяют пациентов (ацетиляторов) с быстрым, промежуточным и медленным типом метаболизма. В нескольких мета-анализах и систематическом обзоре была подтверждена взаимосвязь между медленным фенотипом гена NAT2 и развитием ИИПП [5–9]. Быстрый фенотип ассоциирован со сниженной эффективностью стандартной схемы противотуберкулёзного лечения изониазидом [10, 11]. С помощью определения скорости ацетилирования фермента NАТ2 можно оценить риск развития неблагоприятных побочных реакций (НПР) у пациентов. На основании фармакогенетических исследований Kinzig-Schippers M, et al. (2005), Hasunuma T, et al. (2007), Azuma J, et al. (2013) были установлены наиболее подходящие дозировки изониазида в зависимости от фенотипа NAT2: для медленных, быстрых и промежуточных ацетиляторов составили 2,5; 7,5; и 5 мг/кг соответственно [12–14].

Наибольшее клиническое значение для  выбора дозы изониазида при лечении туберкулёза имеют следующие полиморфизмы NAT2: *4, *5, *6, *7, *12, *13, *14 (https://ww>w.pharmgkb.org/gene/PA18/ clinicalAnnotation/982030222). Пациенты с аллелями *4, *12 и *13 ассоциированы с повышенной скоростью метаболизма изониазида [15]. Пациенты с аллелями *5, *6, *7, *14 имеют риск пониженного метаболизма[15, 16]. Фармакогенетические исследования ассоциации полиморфизмов NAT2 с параметрами безопасности терапии, а также их распространённость среди различных этнических групп необходимы для подбора наиболее эффективного и безопасного курса лечения туберкулёза.

Актуальность изучения вопроса лечения ТБ основана на его высокой распространённости среди населения Российской Федерации (РФ): показатель распространённости ТБ в РФ за 2018 г. – 101,6 на 100 000 населения [1]. ТБ остаётся одним из наиболее распространённых инфекционных заболеваний в Дальневосточном районе, в том числе в Республике Саха (Якутия) в России. В настоящее время выявляется положительная тенденция в распространённости ТБ в данном регионе. Так, в 2017 году заболеваемость ТБ в Якутии составила 58,1 на 100 000 населения, что на 1,7 % ниже, чем в 2016 г. Смертность от туберкулёза в республике составляет 5,6 на 100 000 населения, что в 1,1 раза ниже, чем по России и в 2,2 раза ниже, чем по Дальневосточному федеральному округу [17].

Исследования  распространённости генотипов и фенотипов NAT2 в этнически разнообразных популяциях имеют важное значение для разработки более эффективных подходов к лечению. Так, частота встречаемости быстрых и медленных ацетиляторов различается в африканских популяциях даже среди представителей одних географических регионов [18, 19]. Согласно последним данным, быстрый фенотип NAT2 более распространён среди азиатов и американцев, а медленный – среди русских и французов [20]. Однако население Российской Федерации состоит из множества этносов, что делает необходимым проведение фармакогенетических исследований по выявлению пациентов из групп риска для дальнейшего улучшения качества их лечения.

Материалы и методы

В исследование были включены 158 пациентов с установленным диагнозом «туберкулёз органов дыхания». Среди включённых пациентов 50 относились к этническим якутам (Я), 41 – к русским, проживающим на территории Республики Саха (Якутия) (РЯ) и 67 – к русским, проживающим на территории московского региона (группа сравнения) (РМ). Этническая принадлежность определялась способом самоидентификации, который сопоставим с микросателлитным анализом [21]. Из всех пациентов 91 являлись мужчинами, 67 – женщинами. Средний возраст пациентов: 42,64±14,63 лет. От каждого пациента было получено добровольное информированное согласие на участие в исследовании. Было проведено секвенирование участка гена NAT2 методом Сэнгера с дидезоксинуклеозидтрифосфатами (ddNTP) в несколько этапов: 1) изучаемый фрагмент молекулы ДНК гибридизовался с праймером; 2) затем происходил ферментативный синтез молекулы; 3) на следующей стадии материал подвергался электрофорезу; 4) полученные результаты анализировались на радиоавтографе.

Хроматограммы секвенирования были оценены визуально, проанализированы с применением программного обеспечения FinchTV 1.4 и сравнены с референсной последовательностью NAT2 (https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_000015.2) для определения индивидуальных SNP. Для секвенирования выбрано 6 наиболее значимых полиморфных вариантов: rs1041983 (282C>T), rs1801280 (341T>C), rs1799929 (481C>T), rs1799930 (590G>A), rs1208 (803A>G) и rs1799931 (857G>A) (табл. 1).

С помощью онлайн калькулятора NATpred, который рассчитывает скорость работы ацетилятора с учётом шести полиморфизмов гена, была рассчитана генетически детерминированная скорость метаболизма для каждого пациента (http://nat2pred.rit.albany.edu/ help.html#batch).

Из всех пациентов, проанализированных по фенотипу NAT2, 19 (12) являлись быстрыми ацетиляторами, 66 (41,8) были промежуточными и 73 (46,2) медленными.

Проведённое попарное сравнение типов ацетилирования NAT2 между тремя исследуемыми группами установило, что «быстрые» ацетиляторы значимо чаще встречаются среди якутов по сравнению с русскими, в то время как «медленный» тип метаболизма продемонстрировал обратную тенденцию.

Наглядно частоты разных типов ацетилирования представлены на рис. 1.

Рис. 1. Распространённость фенотипов NAT2 среди якутов и русских, проживающих в Республике Саха (Якутия) и в московской области

Примечание: * – значимые отличия по сравнению с Якутами, р < 0,01

Результаты 

Частоты аллелей среди русских, проживающих в Якутии, полиморфизмов NAT2*5 (Т341С), NAT2*12 (A803G), NAT2*11 (С481Т), а также среди русских, проживающих в московской области, полиморфизмов NAT2*5(Т341С) и NAT2*7(G857A) не соответствовали равновесию Харди-Вайнберга.

При анализе последовательностей NAT2 у пациентов, больных туберкулёзом, проживающих на территории Республики Саха (Якутия), было выявлено 6 полиморфных вариантов NAT2: 3 медленных (NAT2*5(T341C), NAT2*6(G590A), NAT2*7(G857A)) и 3 быстрых (NAT2*11(C481T), NAT2*12(A803G),

NAT2*13(C282T)). Статистически значимые различия были выявлены в распространённости следующих полиморфизмов NAT2: NAT2*5, NAT2*11, NAT2*12, которые чаще встречаются у русских (табл. 2).

Согласно этническим исследованиям, полиморфизм NAT2*5 наиболее распространён среди европейцев (от 35 до 55 [22–24]) и среди представителей Западной Азии (до 40 [24]), а NAT2*7 – среди представителей Центральной, Восточной и Юго-Восточной Азии (до 20 среди азиатов и до 5 среди европейцев) [22–24]. По данным Gra O, et al. (2010), частота встречаемости NAT2*5 среди русских варьируется от 38 до 45 [25]. NAT2*6 имеет примерно одинаковую распространённость во всем мире (10-35) [22, 23]. Полиморфизмы NAT2*12 и NAT2*13 наиболее часто встречаются среди африканцев и редко – среди европейцев и азиатов (до 20 и 12 для первых; до 4 и 2 для вторых) [22, 23]. В исследовании Gra O, et al. (2010) частота NAT2*12 среди русских достигала 0,1 [25].

По результатам нашего исследования наиболее распространёнными полиморфизмами среди РЯ являлись NAT2*5, NAT2*11, NAT2*12 (80,5; 78; 82,9). Среди РМ преобладали полиморфизмы NAT2*5, NAT2*12, NAT2*13 (61,2; 58,2; 58,2). Наименее встречаемым полиморфизмом среди РЯ и РМ являлся NAT2*7 (9,8 и 6 соответственно). Полученные данные по распространённости NAT2*5 и NAT2*7 у русских в целом сопоставимы с вышеописанными исследованиями среди европейцев. Возможными объяснениями несоответствия распространённости NAT2*11, NAT2*12 и NAT2*13 с проведёнными ранее исследованиями, в которых данные полиморфизмы чаще встречаются среди африканцев по сравнению с европеоидами, могут быть региональные особенности.

Наиболее часто встречаемыми полиморфизмами среди якутов являлись NAT2*6, NAT2*13 (40 и 52 соответственно). Приведённая распространённость NAT2*13 не соответствует данным исследований по распределению полиморфизмов NAT2 ни среди азиатов, в том числе в северной и восточной Азии, ни среди европейцев. Необходимо отметить, что разнообразие в распределении различных полиморфизмов NAT2 среди азиатов значительно выше такового среди европейцев [22]. В связи с полученными данными и высокой вариабельностью распространения полиморфизмов NAT2 среди азиатов необходимо проведение дальнейших исследований в различных этнических группах в многонациональных популяциях для создания наиболее полной картины случаев ТБ.

В среднем, до 59 европейцев относятся к медленным ацетиляторам NAT2 [22]. Распространённость медленного фенотипа NAT2 среди азиатов варьируется: наиболее часто встречается в Северной, Западной и Южной Азии; значительно реже в Северно-Восточной (в среднем 18); в Центральной Азии распространённость медленных ацетиляторов сильно варьирует среди населения от 34 до 59 [22].

По результатам нашего исследования выявлено преобладание медленного фенотипа у русских из Якутии и Московской области (63,4 и 55,2 соответственно), что согласуется с вышеописанными данными среди европейцев. Среди якутов преобладали пациенты с промежуточным фенотипом NAT2 (54) и значимо чаще встречались быстрые ацетиляторы (26) по сравнению с русскими пациентами, что согласуется с проведёнными ранее сравнительными исследованиями азиатов и европеоидов.

Заключение

Была выявлена большая распространённость «быстрых» ацетиляторов NAT2 среди якутов по сравнению с русскими, что может являться фактором риска недостаточного ответа на терапию стандартной дозой изониазида. Необходимо иметь в виду данные генетические особенности пациентов при подборе терапии и оценки её эффективности в динамике.

Было обнаружено, что распределение полиморфизмов NAT2 среди якутов не соответствует таковому ни среди азиатов, ни среди европейцев: широкая представленность полиморфизма NAT2*13 (традиционно более распространённого среди африканского населения), а также низкая распространённость NAT2*7 (часто встречаемого среди азиатов) означает, что нельзя экстраполировать данные распределения NAT2 среди азиатов на якутов. Необходимо расширить выборку для более точного анализа результатов.

Литература / References